人乳頭瘤病毒16型E6和E7癌基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響

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人乳頭瘤病毒16型E6和E7癌基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響

王寧，于瑩瑩，王珊珊，喬書培，王偉，閆曉紅，李輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：人乳頭瘤病毒的16型E6和E7癌基因已廣泛用于建立哺乳動(dòng)物的永生化細(xì)胞，但能否用于建立雞的永生化細(xì)胞尚不清楚。試驗(yàn)究克隆人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E6和E7癌基因，分別構(gòu)建這兩個(gè)病毒癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，感染雞前脂肪細(xì)胞后，采用MTT比色法檢測(cè)E6和E7基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，E7基因顯著促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，而E6基因則作用不明顯。本研究為E6和E7基因在雞細(xì)胞永生化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞；人乳頭瘤病毒；E6癌基因；E7癌基因；細(xì)胞增殖

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-27 16:00:36

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1600.009.html

王寧,于瑩瑩,王珊珊,等.人乳頭瘤病毒16型E6和E7癌基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(2): 47-52.

人乳頭瘤病毒（Human papillomaivrus，HPV）是一種雙鏈環(huán)狀DNA腫瘤病毒，根據(jù)其致癌風(fēng)險(xiǎn)性可分為高危型和低危型。HPVl6亞型屬高危型，通常能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA中，表達(dá)的原癌蛋白能激活宿主細(xì)胞中原癌基因，滅活宿主細(xì)胞抑癌基因，致使宿主細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞凋亡異常，引起惡性腫瘤。HPV16編碼的E6、E7蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用，轉(zhuǎn)染HPV-16 E6、E7基因可使多種正常組織細(xì)胞永生化[1]。HPV-16 的E6和E7癌基因可獨(dú)立促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入的永生化，但誘導(dǎo)作用途徑不同。E6蛋白是一種多功能蛋白，該蛋白包含四個(gè)特征性C-X-X-C基序，可形成兩個(gè)鋅指狀結(jié)構(gòu)，E6蛋白還包含具有p300/CBP、E6-AP、myc和PDZ等多種細(xì)胞增殖調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。E6蛋白可降解p53蛋白，增強(qiáng)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的（Human telomerase reverse transciptase，hTERT）表達(dá)和活性，改變細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖[2-6]。E7蛋白能與pRb第649-72位氨基酸的口袋結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，降解pRb，釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使細(xì)胞進(jìn)入S期，避免進(jìn)入DNA損傷應(yīng)答途徑，促進(jìn)細(xì)胞永生化[7]。E7蛋白也可以與RAS、BRCA1和HAT蛋白相互作用，增強(qiáng)hTERT活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。

通過單獨(dú)使用E6和E7癌基因或聯(lián)合使用E6/E7基因與人端粒酶活性重建，已成功建立多個(gè)哺乳動(dòng)物永生化細(xì)胞系，如人角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、人胚胎成纖維細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等的永生化細(xì)胞系[9-12]。雞細(xì)胞的永生化研究進(jìn)展比較慢，已建立的雞永生化細(xì)胞不多。目前已建立的雞永生化細(xì)胞系主要是利用禽類病毒感染獲得，這些細(xì)胞系均是轉(zhuǎn)化細(xì)胞，已喪失其來源組織細(xì)胞特性。由于病毒感染具有宿主特異性，因此，這種方法并不能廣泛使用。病毒癌基因法可建立雞永生化細(xì)胞，但是，病毒癌基因（E6和E7）能否在雞細(xì)胞中發(fā)揮作用，能否用于雞細(xì)胞的永生化研究尚不清楚。為此，本試驗(yàn)構(gòu)建HPV16的E6 和E7癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒后，感染雞前脂肪細(xì)胞后，采用MTT比色法，分析E6和E7對(duì)雞前脂肪細(xì)胞增殖的影響。本研究結(jié)果為雞永生化細(xì)胞系的建立奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1載體、菌株、細(xì)胞株及基因組DNA

本研究選用克隆載體pMDTM18-T Vector及菌株DH5α均購自大連寶生物工程公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLHCX vector以及包裝輔助載體pVSV-G Vector為日本Clontech公司產(chǎn)品；GP2-293包裝細(xì)胞購自美國ATCC生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心；人乳頭瘤病毒16型E6/E7質(zhì)粒由北京協(xié)和醫(yī)院許雪梅教授惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒，DNA純化回收試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自O(shè)mega公司；Opti-MEM?、DMEM、DMEM/F-12購自Gibco公司；Trizol Reagent、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；ImProm-IITMReverse Transcription System均購自美國Promega公司；胰酶、抗生素均購自Sigma公司；FuGENE HD Transfection Reagent購自Roche公司；E6、E7抗體購自北京博奧森試劑公司；ECL顯色液、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔抗體（A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中人HPV16基因（NC_ 001526.2）序列，設(shè)計(jì)HPV-16 E6、E7基因CDS區(qū)克隆引物：E6-F: 5' GCCGAAGCTTATGCACCAAA A 3'，E6-R: 5' CGGGTTAACTTACAGCTGGGG 3'，上下游引物分別攜帶HindⅢ和HpalⅠ酶切位點(diǎn)。E7-F: 5' GCGGTTAACATGCATGGAGATA 3'，E7-R: 5' CGGATCGATTTATGGTTTCTGA 3'，上下游引物分別攜帶HpalⅠ和ClaⅠ酶切位點(diǎn)。選擇β-actin基因作為內(nèi)參基因，以雞β-actin mRNA序列（NM_ 205518）為模版設(shè)計(jì)半定量RT-PCR檢測(cè)引物actin-F: TCTTGGGTATGGAGTCCTG，actin-R:TAGA AGCATTTGCGGTGG。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2基因克隆及載體構(gòu)建

以HPV-16 E6/E7質(zhì)粒為模版，利用2×Pfu master mix DNA聚合酶，擴(kuò)增E6和E7基因的全長編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS）。PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確后，利用引物兩端的酶切位點(diǎn)（HindⅢ和HpalⅠ；HpalⅠ和ClaⅠ）將目的片段亞克隆到pLHCX載體上，構(gòu)建pLHCX-E6和pLHCXE7質(zhì)粒。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)

取12日齡AA肉雞腹部脂肪組織（3~5 g），PBS清洗2遍后，用2 g·L-1的Ⅰ型膠原酶37℃消化1 h，每隔10 min上下顛倒混勻一次，然后，將消化后的組織液依次通過100和600 um的濾網(wǎng)，收集經(jīng)過濾的組織消化液200 g離心10 min，棄上層液體，保留下層液體，加入紅細(xì)胞裂解液處理后，2 000 g離心10 min，棄上清，加入常用培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%FBS）重懸細(xì)胞（雞前脂肪細(xì)胞），以1×105細(xì)胞·cm-2接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。GP2-293細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基（DMEM+ 10%FBS），37℃，5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 Western Blot分析

用6孔板培養(yǎng)GP2-293細(xì)胞，按照羅氏FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說明，分別轉(zhuǎn)染2 μg的pLHCX-E6、pLHCX-E7質(zhì)粒以及pLHCX質(zhì)粒至GP2-293細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，室溫下用PBS洗3次細(xì)胞。按照每孔0.15 mL的量加入細(xì)胞裂解液（RIPA緩沖液），置于冰上，輕輕搖動(dòng)15 min裂解完成后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮于培養(yǎng)孔的一側(cè)，用移液器將細(xì)胞裂解液移至1.5 mL離心管中。10 000 g 4℃離心10 min，上清即為細(xì)胞總裂解物。取細(xì)胞總裂解物40 ug，加入等體積的2×上樣緩沖液與細(xì)胞裂解物混合，100℃加熱5 min使蛋白質(zhì)樣品變性。取每個(gè)變性蛋白質(zhì)樣品10 uL，用BIO-RAD公司的Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE。之后，采用BIO-RAD公司的Mini Trans-Blot系統(tǒng)將蛋白質(zhì)樣品由PAGE膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用含有5%脫脂乳的PBST（含0.05%吐溫的PBS）將硝酸纖維素膜室溫封閉1 h，洗膜后，將膜分別置于一抗的PBST稀釋液中，4℃過夜。其中孵GAPDH抗體的稀釋濃度為1?500，E6抗體和E7抗體的稀釋濃度均為1?500。次日用PBST洗膜3次,每次5 min，然后將膜孵育在含辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（稀釋濃度為1?5 000）的PBST溶液中，置于水平搖床上，室溫孵育1 h，再用PBST洗膜3次，每次5 min，之后進(jìn)行常規(guī)ECL顯色。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備及病毒滴度測(cè)定

將GP2-293細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至90%時(shí)，按照FuGENE HD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pLHCX-E6、 pLHCX-E7和pLHCX分別與pVSV-G表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，72 h后收集病毒液，4℃低速離心去除細(xì)胞碎片，高速離心（50 000 g）90 min后，棄上清，重懸病毒，并利用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取是利用Invitrogen公司的Trizol試劑按照操作說明完成。反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcriptase，RT）以O(shè)ligo（dT）為引物，利用Promega公司的ImProm-Ⅱreverse transcriptase Kit完成。

1.2.7半定量RT-PCR檢測(cè)

將雞前脂肪細(xì)胞接種至12孔板中,待匯合度達(dá)80%~90%時(shí)，分別用pLHCX-E6、pLHCX-E7和pLHCX的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染雞前脂肪細(xì)胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次后，利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA樣品統(tǒng)一調(diào)到200 μg·L-1。以O(shè)ligo（dT）為引物，按照Promega公司的ImProm-Ⅱreverse transcriptase Kit試劑盒操作說明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。利用E6、E7基因和β-actin基因表達(dá)引物（同克隆引物一致），采用半定量RT-PCR檢測(cè)感染后雞前脂肪細(xì)胞內(nèi)E6和E7基因的mRNA表達(dá)。

1.2.8細(xì)胞增殖檢測(cè)

將雞前脂肪細(xì)胞接種至12孔板中,待匯合度達(dá)80%~90%時(shí)，分別利用pLHCX-E6、pLHCX-E7及pLHCX逆轉(zhuǎn)錄病毒感染雞前脂肪細(xì)胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次后，將細(xì)胞消化下來，終止消化，利用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，接種至96孔板（5×103個(gè)·孔-1），每組3個(gè)復(fù)孔，設(shè)為0 h。然后分別在細(xì)胞生長至24、48、72和96 h時(shí)加入MTT （10 uL·孔-1），將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫，搖床上避光振蕩10 min，最后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A490 nm吸光度，并記錄結(jié)果。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SAS 9.2軟件（SAS Institute Inc）分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為xˉ±s，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1 HPV-16 E6和E7基因的克隆

分別設(shè)計(jì)帶有HindⅢ和HpalⅠ酶切位點(diǎn)和及帶有HpalⅠ和ClaⅠ雙酶切位點(diǎn)的E6和E7基因的PCR引物，以HPV-16 E6/E7質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別獲得一個(gè)477 bp的特異性條帶（見圖1a）和一個(gè)297 bp的特異性條帶（見圖1b），試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符。分別回收純化E6和E7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用T載體克隆，分別獲得HPV-16 E6和E7基因的T載體陽性克隆pMD18T-E6和pMD18T-E7。

2.2 HPV-16 E6、E7基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

分別雙酶切pMD18T-E6和pMD18T-E7質(zhì)粒，回收E6和E7基因片段，亞克隆到pLHCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上獲得重組子pLHCX-E6和pLHCX-E7。分別利用HindⅢ和HpalⅠ，HpalⅠ和ClaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖電泳顯示，載體和目的基因條帶大小均與理論值相符（見圖2），進(jìn)一步測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建E6、E7基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。

圖1　HPV-16 E6（a）和E7（b）基因PCR擴(kuò)增Fig. 1　PCR amplification of HPV-16 E6 (a) and E7 (b) genes

圖2　逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLHCX-E6（a）和pLHCX-E7（b）的酶切鑒定Fig. 2　Identification of the retroviral expression vectors of pLHCX-E6 (a) and pLHCX-E7 (b) by double digestion

2.3 HPV-16 E6、E7基因病毒表達(dá)載體的過表達(dá)效果驗(yàn)證

為確認(rèn)pLHCX-E6和pLHCX-E7病毒表達(dá)載體能正確表達(dá)相應(yīng)癌基因E6和E7，將pLHCX-E6、pLHCX-E7和空載體pLHCX分別轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，利用Western blot方法檢測(cè)病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中E6和E7蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pLHCX-E6和pLHCX-E7能表達(dá)出E6和E7蛋白，其中E6蛋白大小約為26 ku，E7蛋白大小約為17 ku，與報(bào)道結(jié)果相符（見圖3），表明本研究構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠在細(xì)胞中真實(shí)表達(dá)E6和E7蛋白，可用于下一步逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備。

2.4 HPV-16 E6、E7基因mRNA水平檢測(cè)

為確認(rèn)包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒能在雞前脂肪細(xì)胞復(fù)制，檢測(cè)病毒感染細(xì)胞中E6、E7基因的mRNA表達(dá)。將制備的E6、E7及空載病毒感染雞前脂肪細(xì)胞后，48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，利用半定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中HPV-16 E6、E7 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，兩組試驗(yàn)均擴(kuò)增特異性條帶，且條帶大小正確（見圖4），說明E6和E7基因逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠感染雞前脂肪細(xì)胞。

2.5 MTT法檢測(cè)E6、E7基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響

將E6、E7和空載體病毒顆粒分別感染雞原代前脂肪細(xì)胞后，利用MTT法檢測(cè)三個(gè)處理組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，接種后細(xì)胞生長至24~ 48 h時(shí)，三個(gè)處理組的細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但各組間無明顯差異；至72 h時(shí)，與感染空載體病毒的對(duì)照組相比，E6基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖作用不顯著，但是E7基因表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖作用（P<0.05），且在96 h時(shí)，這種作用達(dá)到極顯著水平（P<0.01），由此可見，E7基因能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞的增殖，而E6基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖無顯著影響（見圖5）。

圖3　重組質(zhì)粒pLHCX-E6（a）和pLHCX-E7（b）的表達(dá)鑒定Fig. 3　Validation of E6 and E7 protein expression in GP2-293 cells transfected with pLHCX-E6 and pLHCX-E7

圖4　E6（a）、E7（b）基因在感染E6和E7病毒雞前脂肪細(xì)胞中半定量表達(dá)分析Fig. 4　SqRT-PCR analysis of E6 and E7 gene expression in the chicken preadipocytes infected by the retroviruses expressing E6 and E7

圖5　E6和E7對(duì)雞前脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig. 5　Effects of E6 and E7 on chicken preadipocyte proliferation

3　討論與結(jié)論

本研究成功構(gòu)建HPV16病毒癌基因E6和E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，利用MTT法檢測(cè)E6和E7基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E7基因能顯著促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，而E6基因的作用不明顯。Shai等醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，E6和E7基因促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制不同，其中E6基因主要通過與p53蛋白相互作用，使p53蛋白磷酸化，釋放E2F使細(xì)胞增殖抑制解除，促進(jìn)細(xì)胞增殖；而E7基因可使細(xì)胞的抑癌基因pRb失活，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13-16]。人和雞的p53和pRb蛋白同源性分析顯示，人和雞p53蛋白的同源性比較低（62.8%），但pRb蛋白的同源性相對(duì)比較高（72.9%），這可能是E6基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖影響作用不顯著，而E7基因卻顯著促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖作用的原因之一。

在誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞永生化過程中，HPV-16型E6和E7病毒癌基因具有協(xié)同作用。E7蛋白能夠與pRb蛋白結(jié)合，使細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化[17]，但同時(shí)E7蛋白也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[13]，而E6可以通過抑制p53和Bak阻斷細(xì)胞凋亡[1, 18]，對(duì)E7基因起協(xié)同作用。另外，E6和E7基因均可以增強(qiáng)人類細(xì)胞的端粒酶活性，且E7基因能夠增強(qiáng)E6基因誘導(dǎo)的hTERT活性。以往脂肪細(xì)胞永生化研究發(fā)現(xiàn)，盡管E6蛋白可以阻止p300/CBP蛋白乙?；痯53蛋白，降低p53蛋白活性，但E6蛋白結(jié)合p300/CBP蛋白會(huì)抑制p300/CBP蛋白對(duì)脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的激活作用，干擾脂肪細(xì)胞分化。E7蛋白促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖，但并不干擾脂肪細(xì)胞的分化特性[19]。雞的脂肪細(xì)胞分化與哺乳動(dòng)物的相似，也受到PPARγ、C/EBPα等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的級(jí)聯(lián)調(diào)控，p300/CBP蛋白是活化PPARγ、C/EBPα所必需的[20]，由此推斷，E6癌基因不適用于雞前脂肪細(xì)胞永生化的建立。根據(jù)本研究結(jié)果，HPV-16的E7癌基因有望單獨(dú)或聯(lián)合其他癌基因或端粒酶基因用于雞細(xì)胞的永生化研究。

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Effect of HPV-16 E6 and E7 oncogenes on chicken preadipocyte pro-

liferation

/WANG Ning, YU Yingying, WANG Shanshan, QIAO Shupei, WANG Wei, YAN Xiaohong,LI Hui(Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Education Department of Heilongjiang Province, School of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncogenes are widely used in the establishment of immortalized mammalian cells, but it is unclear whether E6 and E7 oncogenes can used for immortalizing chicken cells. In the present study, HPV-16 E6 and E7 genes were cloned and inserted into the retroviral expression vectors. E6 and E7 retroviral expression vectors were packaged into infectious virus particles, respectively. The primary chicken preadipocytes were infected by the retroviruses expressing E6 and E7, respectively. The proliferation of chicken preadipocytes was detected by MTT assay. The results showed that E7 gene significantly promoted chicken preadipocyte proliferation compared with the control group, but E6 gene had no obvious effect on chicken preadipocyte proliferation. Our findings lay the foundation for chicken cell immortalization by E6 and E7 gene.

Key words:chicken; HPV; E6; E7; cell proliferation

作者簡(jiǎn)介：王寧（1964-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail: ningwang2001@yahoo. com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30972086）；973課題（2009CB941604）；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)資助項(xiàng)目（CARS-42）

收稿日期：2014-04-01

文章編號(hào)：1005-9369（2015）02-0047-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：S831