雞氨肽酶N蛋白多克隆抗體制備及其生物學(xué)功能研究

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雞氨肽酶N蛋白多克隆抗體制備及其生物學(xué)功能研究

李廣興1，李蘭蘭1，潘龍1，洪琴1, 2，張恒1, 3，楊巍1，黃小丹1, 4，馬德星1，張瑞莉1，楊貴君1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；

2.上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司生物部，上海200131；

3.山東信得科技股份有限公司，山東濰坊262200；

4.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150080）

摘要：試驗(yàn)參考GenBank上雞氨肽酶N（gAPN）基因序列（登錄號(hào)為NM_204861.1）設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，利用RT-PCR分段克隆gAPN基因各段克隆產(chǎn)物并利用SOE-PCR將其進(jìn)行連接，得到大小為2 906 bp的全長(zhǎng)基因。利用原核表達(dá)載體pET-30a（+）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-gAPN并轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為113 ku目的條帶。以純化gAPN重組蛋白為免疫原制備兔抗gAPN多克隆抗體，間接Elisa方法檢測(cè)多抗血清效價(jià)為215。Western Blot試驗(yàn)證明，此多克隆抗體可以與原核表達(dá)的蛋白產(chǎn)生特異性條帶，同時(shí)與18日齡雞腎組織中獲得的天然gAPN蛋白樣品有良好的反應(yīng)性。間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，多克隆抗體可檢測(cè)到pcDNA-gAPN轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞所表達(dá)的gAPN蛋白。上述結(jié)果可為gAPN蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞氨肽酶N；多克隆抗體；免疫印跡；間接免疫熒光

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-27 16:00:06

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1600.004.html

李廣興,李蘭蘭,潘龍,等.雞氨肽酶N蛋白多克隆抗體制備及其生物學(xué)功能研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(2): 24-31.

Li Guangxing, Li Lanlan, Pan Long, et al. Preparation of polyclonal antibody against chicken amino peptidase N protein and its biological functions[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 24-31. (in Chinese with English abstract)/LI Guangxing1, LI Lanlan1, PAN Long1, HONG Qin1, 2,

Preparation of polyclonal antibody against chicken amino peptidase N

protein and its biological functions

ZHANG Heng1, 3, YANG Wei1, HUANG Xiaodan1, 4, MA Dexing1, ZHANG Ruili1, YANG Guijun1(1. School of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Biology Department, Wuxi AppTec Co., Ltd, Shanghai 200131, China; 3. Shandong Sinder Technology Co., Ltd, Weifang Shandong 262200, China; 4. Heilongjiang Polytechnic, Harbin 150080, China)

Abstract:In this study, specific primers were designed according to the reference gAPN gene (NM_204861.1) of GenBank. The complete chicken amino peptidase N (gAPN) gene of totally 2 906 bp was cloned and linked with RT-PCR and SOE PCR technique. The gAPN was expressed after construction of pET-30a-gAPN and transformed E. coli Rosetta, the molecular weight of gAPN recombinant protein is 113 ku. The purified recombinant protein was used as antigen for preparation of rabbit anti-gAPN polyclonal antibody, the titer of polyclonal antibody was 215. Western Blot showed that this polyclonal antibody had highly reactivity and specialty with recombinant protein and natural gAPN from kidney of 18-day-old of chicken. IFA test demonstrated that this polyclonal antibody could react with the HELA cell transfected with eukaryotic expression plasmid of pcDNA-gAPN.

Key words: chicken amino peptidase N; polyclonal antiserum; Western Blot; indirect fluorescence antibody assay

氨肽酶N（APN）是一種Ⅱ型金屬蛋白酶，主要分布于腎臟、小腸和呼吸道上皮細(xì)胞等處，具有促進(jìn)血管生成、充當(dāng)病毒細(xì)胞受體、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能[1]。冠狀病毒在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中需要受體參與，現(xiàn)已經(jīng)鑒定出與冠狀病毒S蛋白N-端RBDS結(jié)合的細(xì)胞受體包括唾液酸和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（CEACAM1），與C-末端RBDS結(jié)合的細(xì)胞受體包括APN和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 （ACE-2）[2]，但這些可能存在的病毒受體生物學(xué)功能尚需進(jìn)一步研究。

APN可作為多種冠狀病毒的細(xì)胞受體，Alpha屬人和各種動(dòng)物冠狀病毒可利用其自然宿主APN和貓氨肽酶N（fAPN）作為受體[3]。唾液酸也可以作為受體或輔助受體發(fā)揮作用，Gamma屬冠狀病毒IBV以N-乙?；窠?jīng)氨酸（Neu5Ac）作為輔助受體，但I(xiàn)BV與Neu5Ac的結(jié)合域尚未確定[4]。小鼠CEACAM1主要生理功能是介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是所有小鼠肝炎病毒株的主要受體[5]。目前IBV感染是否利用APN作為其受體還未達(dá)成共識(shí)，且APN發(fā)揮受體作用的功能區(qū)尚不清楚。明曉波等對(duì)雞APN在不同雞組織中的分布、定量研究表明，IBV的組織嗜性與APN酶活性存在一定的相關(guān)性，但規(guī)律性不強(qiáng)；采用熒光定量PCR的方法測(cè)定不同日齡雛雞主要組織器官中APN的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明IBV的組織嗜性與APN的自然分布存在明顯的正相關(guān)性，同時(shí)克隆APN基因構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒，利用間接免疫熒光驗(yàn)證雞APN作為IBV的受體可能性[6]。

本試驗(yàn)從雞腎臟中分段克隆全長(zhǎng)gAPN，蛋白成功表達(dá)后制備多克隆抗體，利用Western Blot和間接免疫熒光試驗(yàn)研究其生物活性及其天然活性，為進(jìn)一步證實(shí)APN作為IBV功能受體的可能性奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)載體、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

原核表達(dá)載體pET-30a（+）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理解剖實(shí)驗(yàn)室保存；PCR試劑、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG、高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Maker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；pMD-18T載體、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物公司；感受態(tài)細(xì)胞E. coli JM109、Rosetta購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；新西蘭雌性白兔購(gòu)自哈爾濱市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank上登錄號(hào)為（NM_204861.1）的gAPN基因序列用Premier 5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)以下特異性引物（見(jiàn)表1）對(duì)gAPN基因進(jìn)行分段克隆及對(duì)原核質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建。

1.3雞氨肽酶N總RNA的提取、目的基因的擴(kuò)增及核苷酸序列分析

取28日齡SPF來(lái)航雞的腎臟組織50~100 mg，按Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)提取總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)以O(shè)ligo（dT）18 Primer為反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，先用引物Apn1F，Apn1R；Apn2F，Apn2R；Apn3F，Apn3R分別克隆出三段基因，再采用SOE-PCR，按Ex Taq DNA聚合酶說(shuō)明書(shū)分兩次進(jìn)行g(shù)APN全長(zhǎng)的克隆，先用引物Apn1F，Apn2R進(jìn)行第一次合成，片段長(zhǎng)度為2 062 bp，再使用引物Apn2F，Apn3R合成gAPN全長(zhǎng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，63℃30 s，72℃3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將反應(yīng)產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收的目的基因與pMD-18T載體連接，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化和鑒定，將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序得到的gApn核苷酸序列用DNAstar軟件進(jìn)行分析。

1.4 gAPN原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gAPN和真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-gAPN的構(gòu)建

用引物pET-ApnF、pET-ApnR；pcDNA-apnF、pcDNA-apnR對(duì)gAPN全長(zhǎng)進(jìn)行亞克隆，將亞克隆后的膠回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-30 a（+）、真核表達(dá)載體pcDNA3.1同時(shí)用Eco RⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，純化后用T4DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，挑取單克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-gAPN、pcDNA-gAPN，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1　基因克隆所用特異性引物Table 1　Specific primers used for cloning

1.5重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將pET-gApn和空載體pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta，取100 μL涂布在相應(yīng)抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落于含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，在波長(zhǎng)600 nm處檢測(cè)培養(yǎng)物的OD600=0.5數(shù)值，取1 mL重組菌液培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前對(duì)照，剩余培養(yǎng)物中加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取一次樣，誘導(dǎo)7 h后進(jìn)行SDS-PAGE分析。表達(dá)產(chǎn)物參照文獻(xiàn)[7]所述方法進(jìn)行純化，獲得的產(chǎn)物命名為gAPN蛋白，用透析袋復(fù)性，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 gApn蛋白多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定

1.6.1多克隆抗體的制備

將復(fù)性的gApn蛋白（1 mg·mL-1）與等體積弗氏完全佐劑混合乳化為油乳劑，采用背部多點(diǎn)注射方法對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫，以后每隔一周將純化復(fù)性后的蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化采用皮下多點(diǎn)注射免疫白兔，共免疫4次，最后一次免疫后一周對(duì)白兔進(jìn)行頸動(dòng)脈無(wú)菌取血，分離血清。

1.6.2間接ELISA多克隆抗血清效價(jià)檢測(cè)

用稀釋液（0.1 mol·L-1pH 8.6 NaHCO3）稀釋為10 μg·mL-1的gApn蛋白作為包被抗原，被檢血清按2-5~2-16稀釋度進(jìn)行稀釋，作為一抗進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)多克隆抗血清的抗體效價(jià)。

1.7多克隆抗體的鑒定及生物活性的檢測(cè)

1.7.1抗體特異性的Western Blot檢測(cè)

分別用天然gApn蛋白和重組gApn蛋白與兔抗gApn陽(yáng)性血清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。重組gAPN融合蛋白檢測(cè)時(shí)，使用gAPN融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將gAPN多抗做1?5 000倍稀釋，酶標(biāo)二抗1?1 000倍稀釋，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)；天然gAPN蛋白檢測(cè)時(shí)，取20 mg雞腎臟，加入100 μL組織裂解液進(jìn)行研磨裂解，離心取上清，制備SDS-PAGE樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)印，將gAPN多抗做1?1 000倍稀釋，酶標(biāo)二抗1?1 000倍稀釋，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.7.2多克隆抗體的IFA檢測(cè)

將表達(dá)gAPN蛋白的真核質(zhì)粒pcDNA-gAPN和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染長(zhǎng)滿單層70%的Hela細(xì)胞，24 h后用多聚甲醛固定，一抗為1?100倍稀釋的多抗血清，二抗為1?200倍稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1雞APN基因的克隆

從28日齡雞腎臟提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，用引物Apn1F，Apn1R擴(kuò)增片段大小為864 bp，用引物Apn2F，Apn2R擴(kuò)增片段大小為1 327 bp，用引物Apn3F，Apn3R擴(kuò)增片段大小為759 bp（見(jiàn)圖1），經(jīng)過(guò)兩次SOE-PCR，第一次SOE-PCR擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度約為2 062 bp（見(jiàn)圖2），第二次SOE-PCR成功擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為2 906 bp的目的片段（見(jiàn)圖2），將PCR產(chǎn)物亞克隆到pMD18-T載體，將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒（見(jiàn)圖3）送生物公司測(cè)序，結(jié)果表明所克隆的序列為gAPN全長(zhǎng)?？寺〉膅APN序列已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為JX014437.1。

圖1　gAPN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1　PCR product of gAPN gene

圖2　gAPN基因SOE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 2　SOE-PCR product of gAPN gene

圖3　gAPN基因鑒定結(jié)果Fig. 3　Identification of gAPN gene

2.2序列分析

利用DNAstar軟件，將本試驗(yàn)克隆的gAPN基因和其他幾種動(dòng)物參考APN基因序列（見(jiàn)表2）進(jìn)行比對(duì)（見(jiàn)表3）。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所克隆gAPN基因序列與其他幾個(gè)物種APN序列之間的同源性均在69%以上，表明在各個(gè)物種中存在相同的高度保守區(qū)域，同時(shí)各物種間又存在各種差異的可變區(qū)；其中本文克隆gAPN基因與雞APN參考序列（NM_204861.1）同源性為99.1%，表明雞源APN基因高度保守。

表2　參考動(dòng)物的APN基因序列Table 2　Reference APN gene sequence of different animals

表3　參考動(dòng)物的APN基因同源性分析結(jié)果Table 3　Percent identity analysis of different animal APN genes

2.3雞APN基因的重組原核、真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達(dá)

2.3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

亞克隆gAPN基因插入原核表達(dá)載體pET30a（+）和真核表達(dá)載體pcDNA3.1，PCR和雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gAPN（見(jiàn)圖4）和pcDNA-gAPN（見(jiàn)圖5）均構(gòu)建正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-gAPN和pcDNA-gAPN。

圖4　重組質(zhì)粒pET-gAPN鑒定結(jié)果Fig. 4　Identification of the recombinant plasmid pET-gAPN

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA-gAPN鑒定結(jié)果Fig. 5　Identification of the recombinant plasmid pcDNA-gAPN

2.3.2重組蛋白的表達(dá)

將鑒定正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-gAPN轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)，37℃，1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)7 h（見(jiàn)圖6），可見(jiàn)在116和97 ku間出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)測(cè)的蛋白大小113 ku相符，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸變大，在4 h時(shí)達(dá)到最大。

2.4多克隆抗體的鑒定

2.4.1 gAPN多克隆抗體血清的效價(jià)測(cè)定

用ELISA法測(cè)定gAPN多克隆抗體血清效價(jià)，結(jié)果顯示隨著血清稀釋度的增高，OD值逐步降低，當(dāng)多克隆血清稀釋215倍時(shí)P/N>2，稀釋216倍時(shí)P/N<2確定gAPN多克隆抗體血清效價(jià)為215（見(jiàn)圖7）。

圖6　gAPN蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 6　SDS-PAGE analysis of gAPN protein expression

圖7　多抗血清效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig. 7　ELISA analysis of the binding activities of polyclonal antibody

2.4.2 gAPN蛋白的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

將原核表達(dá)的gAPN蛋白進(jìn)行Western Blot，原核表達(dá)的gAPN大小為113 ku，在130和95 ku見(jiàn)可見(jiàn)特異性單一條帶（見(jiàn)圖8），證明制備的多克隆抗體可以和原核表達(dá)的蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合。

使用從雞腎臟提取的總蛋白進(jìn)行Western blot，天然gAPN蛋白的大小為160 ku，在150和230 ku間可見(jiàn)單一條帶（見(jiàn)圖9），證明制備的多克隆抗體與天然gAPN蛋白可產(chǎn)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)性良好，條帶單一，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖8　原核表達(dá)gAPN蛋白與gAPN多抗的Western BlotFig. 8　Western Blot of prokaryotic expression gAPN withrabbit anti gAPN antiserum

圖9　gAPN多抗與天然gAPN的Western blotFig. 9　Detection Natural gAPN by Western blotting

2.4.3多克隆抗體的IFA檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)圖10。

間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒pcDNA-gAPN的HELA細(xì)胞可以檢測(cè)到特異性熒光（見(jiàn)圖10A），而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞未出現(xiàn)特異性熒光（見(jiàn)圖10B）。

圖10　多克隆抗體的IFA檢測(cè)Fig. 10　Assay of the polyclonal antiserum with indirect fluorescence antibody

3　討論與結(jié)論

氨肽酶N（APN）/CD13是II型金屬蛋白酶，由一個(gè)短N(yùn)-端胞漿域、跨膜部分和包含活性部位的大細(xì)胞胞外結(jié)構(gòu)域組成，共計(jì)967個(gè)氨基酸。APN廣泛存在于各種器官和組織中[8]，高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和各種類型細(xì)胞[9]。天然APN分子質(zhì)量為160 ku，哺乳動(dòng)物APN是普遍存在的多功能酶，與腫瘤發(fā)生和免疫器官發(fā)育有關(guān)，參與抗原和抗原遞呈過(guò)程中微調(diào)。功能有利于對(duì)生物活性肽反應(yīng)（疼痛管理，血管加壓素釋放）調(diào)制和影響免疫功能和主要生物活動(dòng)。目前已經(jīng)證明氨肽酶N可作為Alpha屬冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）[10]、豬病毒性腹瀉病毒（PEDV）[11]的受體。豬呼吸道冠狀病毒（PRCoV）、人類冠狀病毒229E（HCoV-229E）[12]、貓冠狀病毒（FCoV）和犬冠狀病毒（CCoV）利用其自然宿主和貓氨肽酶N（fAPN）作為受體，但貓APN不是Gamma屬冠狀病毒IBV受體[3]。冠狀病毒在識(shí)別受體APN時(shí)是有種屬特異性，且特異性與APN蛋白N-連接糖基化相關(guān)[13]。本研究從28日齡的來(lái)航雞腎臟中提取RNA，利用設(shè)計(jì)的三對(duì)引物克隆出gAPN基因的3個(gè)片段，再利用兩次SOE-PCR成功將3段基因連接在一起得到全長(zhǎng)2 906 bp的gAPN基因。將本試驗(yàn)克隆的gAPN序列與其他幾種動(dòng)物APN序列進(jìn)行同源性分析，表明本試驗(yàn)克隆gAPN基因序列與雞APN參考序列（NM_ 204861.1）同源性為99.1%，表明雞APN基因高度保守；與參考動(dòng)物的序列同源性均在69%以上，各個(gè)物種間存在相同的保守區(qū)域，這些區(qū)域高度保守，各物種間又存在各種差異可變區(qū)，這些可變區(qū)是各物種在進(jìn)化過(guò)程中形成。Wentworth等試驗(yàn)證明，受體結(jié)合位點(diǎn)和功能性的氨基酸都位于各物種APN基因的高變區(qū)，在APN上已經(jīng)確定3個(gè)受體結(jié)合區(qū)域均位于其表面（AA 283-292，vbm 1；AA 728-744，vbm 2；AA 760-784，vbm 3），F(xiàn)CoV和CCoV可以結(jié)合vbm 2和vbm 3；PRCOV主要結(jié)合pAPN的AA 783 和787[14]；HCoV-229E結(jié)合AA 283-292（vbm1）[15]。

本文進(jìn)行g(shù)APN原核重組蛋白的表達(dá)和多抗制備，間接免疫熒光試驗(yàn)證明制備多抗和真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HELA細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光，同時(shí)此多抗還可以與雞腎臟中的天然結(jié)構(gòu)gAPN蛋白特異性結(jié)合，證明此多抗具有較好的與天然APN結(jié)合能力。本實(shí)驗(yàn)室利用Western Blot證明原核表達(dá)gAPN蛋白可以和IBV病毒反應(yīng)，由于SDS-PAGE是變性電泳，SDS將蛋白質(zhì)變性，使之失去天然結(jié)構(gòu)，證明gAPN與IBV結(jié)合不依賴蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，與酶的活性中心無(wú)關(guān)，這與Costa等其他冠狀病毒相關(guān)受體研究結(jié)果一致[16]，提示gAPN可作為IBV可能的功能性受體在病毒侵染細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用。本文中g(shù)APN重組蛋白表達(dá)和多克隆抗體的制備及其生物學(xué)活性研究對(duì)檢測(cè)分析雞各種組織和器官中g(shù)APN的分布和含量，可為分析其在IBV侵染細(xì)胞中的生物學(xué)作用及闡明該病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Look A T, Ashmun R A, Shapiro L H, et al. Human myeloid plasma membrane glycoprotein CD13 (gp150) is identical to aminopeptidase N[J]. J Clin Invest, 1989, 83(4): 1299-1307.

[2]陳漢陽(yáng).雞傳染性支氣管炎病毒感染HeLa細(xì)胞的研究及其天然受體的鑒定[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[3]Tresnan D B, Holmes K V. Feline aminopeptidase N is a receptor for all group I oronaviruses[J]. Adv Exp Med Biol, 1998, 440: 69-75.

[4] Winter C, Herrler G, Neumann U. Infection of the tracheal epithelium by infectious bronchitis virus is sialic acid dependent [J]. Microbes Infect, 2008, 10(4): 367-373.

[5]De Groot R J. Structure, function and evolution of the hemagglutinin-esterase proteins of corona- and toroviruses[J]. Glycoconj J, 2006, 23(1-2): 59-72.

[6]明曉波.雞APN組織定量、表達(dá)及其作為IBV受體可能性評(píng)價(jià)[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[7]王明翠,任曉峰,李廣興．缺失信號(hào)肽和跨膜區(qū)的PRRSV GP5融合蛋白基因的表達(dá)[J]．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2010, 40(4): 342-346.

[8]Semenza G. Anchoring and biosynthesis of stalked brush border membrane proteins: glycosidases and peptidases of enterocytes and renal tubuli[J]. Annu Rev Cell Biol, 1986(2): 255-313.

[9]Look A T, Ashmun R A, Shapiro L H, et al. Human myeloid plasma membrane glycoprotein CD13 (gp150) is identical to aminopeptidase N[J]. J Clin Invest, 1989, 83(4): 1299-1307.

[10]Delmas B, Gelfi J, L'Haridon R, et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV[J]. Nature, 1992, 357(6377): 417-420.

[11]Li B X, Ge J W, Li Y J. Porcine aminopeptidase N is a functional receptorforthe PEDVcoronavirus[J].Virology,2007,365(1):166-172.

[12]Yeager C L, Ashmun R A, Williams R K, et al. Human aminopeptidase N is a receptor for human coronavirus 229E[J]. Nature, 1992, 357(6377): 420-422.

[13]Tusell S M, Schittone S A, Holmes K V. Mutational analysis of aminopeptidase N, a receptor for several group 1 coronaviruses, identifies key determinants of viral host range[J]. J Virol, 2007, 81 (3): 1261-1273.

[14]Reguera J, Santiago C, Mudgal G, et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(8): e1002859.

[15]Wentworth D E, Holmes K V. Molecular determinants of species specificity in the coronavirus receptor aminopeptidase N (CD13): influence of N-linked glycosylation[J]. J Virol, 2001, 75(20): 9741-9752.

[16]Costa T, Chaves A J, Valle R, et al. Distribution patterns of influenza virus receptors and viral attachment patterns in the respiratory and intestinal tracts of seven avian species[J]. Vet Res, 2012, 43(1): 28.

作者簡(jiǎn)介：李廣興（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物病理學(xué)。E-mail: ligx@neau. edu. cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172295，31272569）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZJN0702-01）

收稿日期：2014-02-27

文章編號(hào)：1005-9369（2015）02-0024-08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：S852.23