結(jié)核T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎中的價(jià)值

莊 妍，賴雁平

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，天津 300211）

結(jié)核病大多表現(xiàn)為肺結(jié)核，但仍有15%～25%的患者為淋巴結(jié)結(jié)核或結(jié)核性胸膜炎[1]。該病臨床癥狀多不典型，確診需在胸腔積液或胸膜組織中找到結(jié)核菌，但結(jié)核菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率低，培養(yǎng)周期長(zhǎng)。應(yīng)用胸膜活檢也可以確診，但具有創(chuàng)傷性，使其應(yīng)用受限。目前外周血結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）對(duì)于結(jié)核病的輔助診斷價(jià)值得到國(guó)內(nèi)外的一致認(rèn)同，但胸腔積液T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值仍存在爭(zhēng)議。90%結(jié)核性胸膜炎表現(xiàn)為以淋巴細(xì)胞為主的滲出性胸腔積液，因此在臨床工作中，此檢驗(yàn)結(jié)果多提示高度可疑結(jié)核性胸膜炎。本研究旨在探討T-SPOT.TB對(duì)鑒別診斷結(jié)核性胸膜炎和其他淋巴細(xì)胞為主的滲出性胸腔積液的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1月-2014年4月我院呼吸科收治的單側(cè)胸腔積液患者63例，其均符合淋巴細(xì)胞為主的滲出性胸腔積液。滲出液的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Light’s標(biāo)準(zhǔn)[2]，即以下3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中符合任何一項(xiàng)即可確診為滲出液，均不符合則為漏出液：（1）胸液/血清蛋白（P/SPro）＞0.5；（2）胸液/血清乳酸脫氫酶（P/SLDH）＞0.6；（3）胸液乳酸脫氫酶（PE LDH）大于正常血清乳酸脫氫酶上限的2/3。淋巴細(xì)胞為主的診斷標(biāo)準(zhǔn)為胸腔積液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中淋巴細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例>50%。全部病例中結(jié)核性胸膜炎患者32例，其中經(jīng)病原學(xué)確診（胸腔積液或胸膜活檢組織培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌）13例，經(jīng)組織學(xué)確診（胸膜活檢病理示干酪樣肉芽腫）6例，臨床診斷[3]13例，且經(jīng)抗結(jié)核治療有效。非結(jié)核性胸膜炎患者31例，均已排除結(jié)核性胸膜炎，且明確診斷其他疾病，經(jīng)治療原發(fā)病有效。其中惡性胸腔積液19例（肺癌16例、乳腺癌1例、卵巢癌1例、淋巴瘤1例），肺炎旁胸腔積液9例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1例，肝硬化1例。入選者均簽署知情同意書，且排除：<16歲，孕婦，HIV陽(yáng)性，近1周內(nèi)應(yīng)用利尿劑，因肝病或嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良所致低蛋白血癥。

1.2 方法 采集所有患者（治療前）外周靜脈血5 mL和新鮮胸腔積液50mL，應(yīng)用肝素抗凝管，室溫保存，標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送檢，4 h內(nèi)完成檢測(cè)。應(yīng)用T-SPOT.TB試劑盒（英國(guó)，Oxford Immunotec公司），標(biāo)本經(jīng)分離得到外周血單核細(xì)胞（PBMCs）和胸液?jiǎn)魏思?xì)胞（PEMCs），制備成細(xì)胞懸液。在包被γ-干擾素抗體的微孔板上，加入細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，植物血凝素作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原—早期分泌靶向抗原6 kD和培養(yǎng)濾過蛋白10 kD作為刺激抗原。每孔加入細(xì)胞懸液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，4℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液，靜置7min，去離子水終止反應(yīng)。通過T淋巴細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)記錄斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。結(jié)果判定：若陰性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)<10，且陽(yáng)性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)>20，試驗(yàn)有效。若空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6，且任一試驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)－空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>6，且任一試驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2×空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)時(shí)，結(jié)果亦為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。敏感性=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)，特異性=1－敏感性。所有數(shù)據(jù)均首先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù) [四分位間距]表示，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。兩組間一般情況中的分類變量及反應(yīng)率比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線對(duì)診斷價(jià)值進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者基本情況及檢驗(yàn)指標(biāo) 表1列出了受試者的年齡、性別、近1月有無應(yīng)用激素或免疫抑制劑、有無結(jié)核病史或影像學(xué)陳舊性肺結(jié)核改變、有無糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病及外周血和胸腔積液中的一些檢驗(yàn)指標(biāo)，其中結(jié)核性胸膜炎組胸液中的中性粒細(xì)胞比例較非結(jié)核性胸膜炎組高（P<0.05）。

表1 受試者基本情況及檢驗(yàn)指標(biāo)Tab1 Generalcausesand physicalexam inationsof sub jects

2.2 T-SPOT.TB測(cè)定 32例結(jié)核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果為29例陽(yáng)性，3例陰性，胸腔積液檢測(cè)結(jié)果為30例陽(yáng)性，2例陰性。31例非結(jié)核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果為10例陽(yáng)性，21例陰性，胸腔積液檢測(cè)結(jié)果為3例陽(yáng)性，28例陰性。胸腔積液檢測(cè)的敏感性高于外周血，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；其特異性明顯高于外周血（P<0.05）。胸腔積液釋放γ-干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)顯著高于外周血（P<0.05）。見表2。

表2 外周血與胸腔積液的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果Tab2 The data of serum and pleural T-SPOT.TB

2.3 繪制ROC曲線 在63例胸腔積液患者中，以病原學(xué)/組織學(xué)或臨床診斷作為確定結(jié)核性胸膜炎的標(biāo)準(zhǔn)，以釋放γ-干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，見圖1。外周血的ROC曲線下面積為0.880，當(dāng)取值分別為21和75 SFCs/106PBMC時(shí)，敏感性分別為81.3%和65.6%，特異性為77.4%和96.8%。胸腔積液的ROC曲線下面積為0.964，當(dāng)取值分別為12和133SFCs/106PEMC時(shí)，敏感性分別為93.8%和81.3%，特異性為90.3%和96.8%。

圖1 外周血及胸腔積液T-SPOT.TB的ROC曲線Fig 1 ROC curveof serum and pleural T-SPOT.TB

3 討論

結(jié)核桿菌感染產(chǎn)生以細(xì)胞介導(dǎo)為主的免疫反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞在初次感染致敏后成為記憶T細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，當(dāng)再次接觸結(jié)核桿菌時(shí)活化增殖為效應(yīng)T細(xì)胞，釋放多種細(xì)胞因子，其中由輔助T淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+）產(chǎn)生的 γ-干擾素是最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子[4-5]。T-SPOT.TB以早期分泌靶向抗原6 kD和培養(yǎng)濾過蛋白10 kD為特異性抗原，刺激從外周血或體液分離的單核細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素，再通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)計(jì)數(shù)特異性T細(xì)胞數(shù)目。這些特異性抗原由RD1基因區(qū)所編碼，該區(qū)域僅存在于結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)致病性分枝桿菌的基因組中，不存在于非致病性分枝桿菌屬和卡介苗疫苗株中，且兩種抗原聯(lián)合檢測(cè)針對(duì)不同表位進(jìn)行反應(yīng)，從理論上保證了T-SPOT.TB的高敏感性和特異性。但在結(jié)核病流行地區(qū)，外周血T-SPOT.TB的特異性較低，為67.0%～90.5%[6-7]，這是由于結(jié)核疫區(qū)存在較多的潛伏感染患者所致。理論上活動(dòng)性結(jié)核感染的T-SPOT.TB的斑點(diǎn)數(shù)應(yīng)較潛伏性感染更多，但事實(shí)并非如此，其可能的原因?yàn)椋寒?dāng)潛伏性結(jié)核感染者的免疫功能良好時(shí)，少量抗原刺激就能激發(fā)出活躍的免疫反應(yīng)；或者當(dāng)活動(dòng)性結(jié)核患者免疫功能低下時(shí)，大量抗原刺激也不足以激起有效的免疫反應(yīng)。在此種背景下，選擇特異性較高的臨界值，比根據(jù)ROC曲線確定的最佳臨界值更有意義[8]。作為臨床醫(yī)生，需要在不同的臨床背景下選擇對(duì)于實(shí)際工作最理想的臨界值。正如本研究所示，在外周血及胸液臨界值分別取值75 SFCs/106PBMC和133 SFCs/106PEMC時(shí)，其特異性較高。在肺外結(jié)核病中，結(jié)核抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞迅速增殖，并被募集到感染部位，病變局部呈免疫病理學(xué)的隔室化反應(yīng)[9]，故外周血中的效應(yīng)T細(xì)胞減少，感染部位的效應(yīng)T細(xì)胞增多，因此理論上認(rèn)為對(duì)感染部位進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)有可能獲得更高的敏感性和特異性。目前有學(xué)者認(rèn)為T-SPOT.TB的檢測(cè)范圍已不僅局限于外周血，還可應(yīng)用于痰液、胸水、腹水及腦脊液等[10-11]。但對(duì)于胸腔積液T-SPOT.TB的研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議，有些學(xué)者認(rèn)為其對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值高于外周血[12-13]，有些則認(rèn)為其不確定因素較多，結(jié)果不盡人意[8]。而我們的研究認(rèn)為胸液T-SPOT.TB的敏感性、特異性均高于外周血。

結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核分枝桿菌及代謝產(chǎn)物直接侵及胸膜腔引起的胸膜炎癥，多表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞為主的滲出性胸腔積液。在臨床工作中，肺炎旁胸腔積液、膿胸的患者通常表現(xiàn)為高熱、嚴(yán)重感染癥狀、血象升高，胸腔積液為膿性或中性粒細(xì)胞為主，與結(jié)核性胸膜炎鑒別診斷較容易。但仍有17%的結(jié)核性胸膜炎的胸腔積液中淋巴細(xì)胞比例<50%，本研究只討論了淋巴細(xì)胞為主的滲出性胸腔積液中TSPOT.TB的診斷價(jià)值，而以中性粒細(xì)胞為主的滲出液未在研究范圍之內(nèi)。此外，本研究通過Light’s標(biāo)準(zhǔn)判定滲出性胸腔積液，但應(yīng)用利尿劑可以將一部分漏出液錯(cuò)誤地判斷為滲出液，且低蛋白血癥亦可能影響滲出液的判定，因此本研究將近1周內(nèi)應(yīng)用利尿劑及各種原因所致的低蛋白血癥患者作為排除標(biāo)準(zhǔn)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于T-SPOT.TB的研究樣本量均偏小，本研究同樣存在此問題，尚需在今后的研究中擴(kuò)大樣本量；另外，最終診斷為結(jié)核性胸膜炎的個(gè)別病例通過臨床確診，可能會(huì)影響結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性，但若將臨床確診病例全部排除，只研究微生物或病理確診病例，可能仍不可避免地造成結(jié)論存在一定偏差。

最終，我們的研究得到以下兩個(gè)主要結(jié)論：一是胸液T-SPOT.TB是較好的診斷結(jié)核性胸膜炎的指標(biāo);二是當(dāng)胸液T-SPOT.TB斑點(diǎn)數(shù)≥133 SFCs/106PEMC時(shí)具有較高的診斷特異性。

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