氟喹諾酮類制劑中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和安乃近的測(cè)定方法研究

董玲玲，楊 星，范 強(qiáng)，郝利華，萬仁玲

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081）

氟喹諾酮類藥物因能通過干擾DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成而起殺菌作用，而被廣泛使用。但一些不法生產(chǎn)企業(yè)為提高產(chǎn)品療效而非法添加處方外藥物。目前，根據(jù)監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)的問題，有添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的現(xiàn)象。參考已建立的一些非法添加檢查方法[1-2]，本研究以薄層色譜法進(jìn)行初篩，以高效液相色譜方法進(jìn)行確證，建立了氟喹諾酮類制劑中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和安乃近的檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（Waters 2695，PDA，Empower2色譜工作站軟件）；分析天平（十萬分之一）；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純；甲醇為色譜純。

1.2 試藥 對(duì)乙酰氨基酚：（批號(hào)：10116942，Al?faAesar）；安乃近：（批號(hào)：950811，南通制藥廠）。陰性供試品：恩諾沙星、煙酸諾氟沙星、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星可溶性粉及注射液；供試品：恩諾沙星可溶性粉（按1%添加安乃近）、乳酸環(huán)丙沙星注射液。氟喹諾酮類對(duì)照品均來自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜方法

2.1.1 檢驗(yàn)方法 取供試品1.0 g或1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取對(duì)乙酰氨基酚和安乃近對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL中含對(duì)乙酰胺氨基酚或安乃近1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取上述溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視：氟喹諾酮類藥物在原點(diǎn)顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)位置未顯示與對(duì)照品相同顏色的熒光斑點(diǎn)，無干擾。供試品色譜中，在對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖1 薄層色譜結(jié)果

2.1.2 薄層色譜檢測(cè)限 取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，取0.5、1、2、5、10、20 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，在上述薄層色譜條件下，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果顯示，點(diǎn)樣體積為1μL時(shí)，斑點(diǎn)基本可見，故確定在該薄層色譜條件下對(duì)乙酰氨基酚檢測(cè)限為0.1μg。另取安乃近對(duì)照品同法操作，結(jié)果顯示，點(diǎn)樣體積為2μL時(shí)，斑點(diǎn)基本可見，故確定安乃近檢測(cè)限為0.2μg。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用氫氧化鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為200 nm～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄244 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、4-甲基安替比林（MAA）與氟喹諾酮類藥物的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2.2 溶液配制

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2.2.1 供試品溶液和對(duì)照品溶液 取供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲5 min后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；量取1.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取對(duì)乙酰氨基酚、安乃近對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 氟喹諾酮類制劑空白溶液 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲5 min，加甲醇至刻度；取1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜光譜

2.2.3 測(cè)定法 取上述各溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。

2.2.4 峰純度檢查 對(duì)供試品溶液色譜圖中對(duì)乙酰氨基酚、安乃近色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚峰與安乃近峰的純度角度均小于純度閾值，表明在此液相條件下，對(duì)乙酰氨基酚峰與安乃近的出峰處無其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

2.2.5 光譜相似度檢查 對(duì)供試品溶液中對(duì)乙酰氨基酚峰、安乃近峰的光譜圖與對(duì)照品的進(jìn)行匹配，匹配角度均小于匹配閾值，表明供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與對(duì)乙酰氨基酚、安乃近對(duì)照品的光譜非常相似，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

圖3 供試品色譜光譜圖1

圖4 供試品色譜光譜圖2

2.2.6 檢出限 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加1 mg/mL的對(duì)乙酰氨基酚溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL或5 mg/mL的安乃近儲(chǔ)備液 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置25 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢出限，對(duì)乙酰氨基酚檢出限為0.5μg/g（mL），安乃近檢出限為5 μg/g（mL）。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，精密加對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品適量，按2.2.2.1法制備回收率試驗(yàn)溶液，平行配制6份。立即測(cè)定并計(jì)算，對(duì)乙酰氨基酚平均回收率為101.2%，RSD為0.5%；另取安乃近對(duì)照品及氟喹諾酮類可溶性粉，同法操作，安乃近平均回收率為101.0%，RSD為0.5%。

2.2.8 耐用性 從柱溫、流動(dòng)相pH值、色譜柱3個(gè)方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為20℃、25℃和30℃，隨柱溫升高，保留時(shí)間略提前，但差異小于0.2 min；調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為6.8、7.0和7.2，保留時(shí)間幾乎不變；選擇4款不同品牌、填料的色譜柱進(jìn)行考察，分離度均大于1.5，結(jié)果顯示方法耐用性較好。

3 討論

按《中國(guó)獸藥典》2010年版一部對(duì)某企業(yè)乳酸環(huán)丙沙星注射液進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在液相色譜圖中除環(huán)丙沙星色譜峰外還有一異常峰，根據(jù)光譜圖形狀及最大吸收，懷疑可能為解熱鎮(zhèn)痛類藥物峰。通過薄層色譜法與對(duì)乙酰氨基酚、安乃近對(duì)照品斑點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，懷疑可能摻入了對(duì)乙酰氨基酚，并通過高效液相色譜法（PDA法）進(jìn)行了確證。

安乃近遇水迅速水解成活性代謝物4-甲氨基安替比林（MAA）[3]，故選擇純甲醇作為溶媒。而氟喹諾酮類注射劑均為水溶液，在進(jìn)行回收率試驗(yàn)時(shí)，色譜圖中會(huì)出現(xiàn)MAA色譜峰，且隨著樣品放置時(shí)間的延長(zhǎng)，MAA峰面積會(huì)增大。此時(shí)，以安乃近與MAA峰面積之和計(jì)算，平均回收率為101.0%，RSD為0.7%，與未產(chǎn)生MAA色譜峰的安乃近平均回收率結(jié)果一致。故當(dāng)氟喹諾酮類注射液中摻入安乃近時(shí)，僅以安乃近色譜峰計(jì)算會(huì)使結(jié)果偏低，故應(yīng)考慮以安乃近與MAA峰面積之和計(jì)算安乃近的摻入量。

4 結(jié)論

本檢驗(yàn)方法中薄層色譜法展開時(shí)間短，且氟喹諾酮類藥物在原點(diǎn)顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，能迅速篩查出是否含有非法添加物。再通過保留時(shí)間及光譜圖與對(duì)照品的進(jìn)行比對(duì)，能實(shí)現(xiàn)氟喹諾酮類制劑中非法添加對(duì)乙酰氨基酚、安乃近的高效、快速、準(zhǔn)確識(shí)別。

本檢驗(yàn)方法針對(duì)4種氟喹諾酮類可溶性粉及注射液，用于其他氟喹諾酮類制劑時(shí)，需進(jìn)行空白試驗(yàn)和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

[1]李文莉，萬勝利，趙勇，等.天麻膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中補(bǔ)充檢驗(yàn)對(duì)乙酰氨基酚的方法[J].藥物分析雜志，2013，33（6）：1041-1044.

[2]郝利華，董玲玲，于曉輝，等.薄層色譜法快速篩選黃芪多糖注射液中非法添加的化學(xué)物質(zhì)[J].中國(guó)獸藥雜志，2012，46（5）：29-30.

[3]沈金燦，龐國(guó)芳，謝麗琪，等.牛和豬肌肉組織中安乃近代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué)，2007，35（11）：1565-1569.