多蒴曲尾蘚提取液的抑真菌活性

劉俊華+李玉璽+馬海玲

摘要：采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)2種方法，分析比較了藥用植物多蒴曲尾蘚配子體提取液對(duì)植物病原真菌大莖點(diǎn)霉的抑菌活性。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度為120 g/L時(shí)，無菌水和80%乙醇2種溶劑蘚體提取液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌絲生長(zhǎng)的抑菌率均達(dá)60%以上，其中乙醇提取液的抑菌作用較強(qiáng)，抑菌率為67.47%，EC50 值為27.28 g/L;乙醇提取液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑菌活性高于對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性，EC50值為19.62 g/L，抑制作用優(yōu)于水提液。多蒴曲尾蘚對(duì)大莖點(diǎn)霉具有良好的抑菌效果，在冬棗輪紋病生物防治方面具有一定的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：多蒴曲尾蘚提取物;抑菌活性;大莖點(diǎn)霉;抑菌中濃度

中圖分類號(hào)： S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0141-02

收稿日期：2014-05-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃 （編號(hào)：201210449111）;濱州學(xué)院自然科學(xué)基金（編號(hào)：BZXYLG200701）。

作者簡(jiǎn)介：劉俊華（1980—），男，山東高唐人，碩士，講師，主要從事植物生態(tài)學(xué)教學(xué)與研究。Tel：（0543）3191727;E-mail：liujh1980@126.com。

植物病原真菌對(duì)農(nóng)作物的危害較嚴(yán)重，尋求環(huán)境兼容性好、安全、低毒、經(jīng)濟(jì)的植物源農(nóng)藥控制真菌引起的農(nóng)作物病害已成為一種趨勢(shì)[1]。我國(guó)擁有十分豐富的植物資源，且相當(dāng)多的物種具有藥用價(jià)值。多蒴曲尾蘚（Dicranum majus Turn.）為曲尾蘚科（Dicranaceae）曲尾蘚屬（Dicranum Hedw.）植物[2]，是廣泛分布于我國(guó)的一種常見藥用蘚類，其體內(nèi)富含多種氨基酸[3]。據(jù)中醫(yī)古籍記載，該蘚全草入藥，氣微，味淡，有清肺止咳功效，多用于治療肺熱咳嗽[3]，在我國(guó)民間多有使用，但有關(guān)其抑菌活性方面的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以山東省內(nèi)山區(qū)采集的多蒴曲尾蘚配子體為試材，以冬棗輪紋病致病菌大莖點(diǎn)霉菌[4]為受試菌株，利用其配子體水提液、醇提液進(jìn)行抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)研究，旨在初步闡明多蒴曲尾蘚抑制真菌活性，為開發(fā)以多蒴曲尾蘚為植物源的殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用多蒴曲尾蘚配子體，采自山東省境內(nèi)鶴伴山區(qū)林下陰濕巖面。野外采集帶回室內(nèi)，用清水洗凈后自然風(fēng)干，研磨成粉，冷藏備用。供試菌株為大莖點(diǎn)霉菌（Macrophoma kuwatsukaii），系冬棗輪紋病的病原菌，由濱州學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取液的制備 準(zhǔn)確稱取多蒴曲尾蘚配子體干粉12 g 放入250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇作為提取溶劑，置于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提24 h。以4 000 r/min 離心 15 min，收集上清液即為浸提液，定容至100 mL，得濃度為120 g/L的提取母液。然后依次稀釋得到濃度為60、30、15、7.5、3.75 g/L的多蒴曲尾蘚提取液;同樣方法制備得到多蒴曲尾蘚配子體水提液，均于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備 將上述配制好的提取液分別加入到盛有30 mL PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中制成含藥（蘚體提取液）培養(yǎng)基;同時(shí)，以加入相同體積無菌水、80%乙醇PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定提取液抑菌活性 按菌絲生長(zhǎng)速率法計(jì)算抑菌率。待菌絲即將長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，在菌絲生長(zhǎng)旺盛處用打孔器打取直徑為6 mm的菌餅，接種于帶藥液培養(yǎng)基中心位置，每皿接1個(gè)菌餅，每個(gè)濃度接種3皿（即每處理3個(gè)重復(fù)）;置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，觀察大莖點(diǎn)霉菌的生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺以“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑（精確至0.1 mm）。抑菌率計(jì)算公式如下：

抑菌率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-6 mm）]×100%。

1.2.4 稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定提取物對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑制率 吸取前期活化并制備好的菌懸液，分別加入到上述不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，用涂菌棒涂布均勻后靜置20 min，再將培養(yǎng)基平板倒置，于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;準(zhǔn)確記測(cè)菌落數(shù)。對(duì)照組（分別以無菌水培養(yǎng)和80%乙醇培養(yǎng)）菌落數(shù)記為C0，涂布提取物平板菌落數(shù)記為C，按下式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率：抑制率=[（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/（對(duì)照萌發(fā)率）]×100%=[（C0-C）/C0]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans 新復(fù)極差法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn);運(yùn)用提取物對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)影響的回歸方程，計(jì)算相應(yīng)EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 多蒴曲尾蘚提取物對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表1可知，多蒴曲尾蘚水提液和醇提液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，在質(zhì)量濃度為3.75 g/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為10.45%和13.85%，抑菌活性隨提取液濃度提高而增強(qiáng)，質(zhì)量濃度至120 g/L時(shí)，2種提取液抑制率均達(dá)到60%以上，分別為62.92%和67.47%。同時(shí)，從菌絲生長(zhǎng)情況來看，處理組與對(duì)照組相比，菌落直徑明顯減小，菌絲稀疏、纖細(xì)，且易老化。

表1 多蒴曲尾蘚提取物對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

質(zhì)量濃度

（g/L）

菌環(huán)直徑（mm） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 26.2±3.37a 29.9±4.10a 62.92±5.08a 67.47±4.17aendprint

60 29.6±3.60a 32.8±5.00a 59.33±6.19a 63.29±4.47a

30 36.9±2.90a 36.7±4.55b 54.58±5.64a 54.20±3.60b

15 43.4±3.97b 46.1±3.56c 42.90±4.41b 46.13±4.93c

7.5 54.8±3.76c 57.5±4.29d 28.82±5.31c 32.04±4.66d

3.75 69.5±3.48d 72.3±5.10e 10.45±6.32d 13.85±4.32e

0（CK） 80.6±2.74e 80.7±3.06f 0e 0f

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)小寫字母表示不同質(zhì)量濃度處理間差異顯著（P<0.05）。表2同。

由圖1可知，提取液質(zhì)量濃度與抑菌率間呈正相關(guān)關(guān)系，其中水提液抑菌力回歸方程為y=15.069lnx-2.864 3（r2=0.922 7，P=0.077），醇提液抑菌力回歸方程為y=15248lnx-0.413 7（r2=0.951，P=0.057）;進(jìn)一步計(jì)算得到2種提取液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值，分別為27.61 g/L（水提液）、27.28 g/L（醇提液）。

2.2 多蒴曲尾蘚提取物對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

植物病原菌在萌發(fā)階段對(duì)外來藥劑較為敏感，且其孢子萌發(fā)率隨藥液濃度增大呈明顯下降趨勢(shì)。由表2可知，多蒴曲尾蘚對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著提取液質(zhì)量濃度的增高，抑制作用顯著增強(qiáng)。

表2 多蒴曲尾蘚提取液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

質(zhì)量濃度

（g/L）

菌落數(shù)（個(gè)） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 4.7±2.08a 2.7±1.53a 83.53±2.08a 89.61±1.53a

60 7.7±2.52ab 6.3±1.53b 72.94±2.52ab 75.32±1.53b

30 11.7±2.08b 10.7±2.08c 58.82±2.08b 58.44±2.08c

15 16.3±2.52c 14.0±2.00c 42.35±2.52c 45.45±2.0c

7.5 21.0±2.65d 18.3±1.53d 25.88±2.65d 28.57±1.53d

3.75 25.3±2.08e 22.3±2.52e 10.59±2.08de 12.99±2.52e

0（CK） 28.3±3.51e 25.7±2.52e 0e 0e

由圖2可知，醇提液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用略強(qiáng)于水提液。通過對(duì)提取液質(zhì)量濃度與孢子萌發(fā)抑制率間進(jìn)行回歸分析，得到水提液和醇提液與孢子萌發(fā)抑制率間的回歸方程，分別為：y=22.108lnx-15.801（r2=0.995 4，P=0.022）、y=21.531lnx-16.751（r2=0.999 1，P=0014），依方程計(jì)算得2種提取液抑制大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的EC50值，分別為22.20 g/L、19.62 g/L。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：多蒴曲尾蘚提取液對(duì)冬棗輪紋病致病菌大莖點(diǎn)霉的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，在供試質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，多蒴曲尾蘚提取液對(duì)大莖點(diǎn)霉菌的抑制率均在60%以上，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)80%以上，其抑菌活性隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，且在中高濃度下（30～120 g/L）2種提取液大莖點(diǎn)霉菌孢子萌發(fā)的抑制率高于對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的抑制率。無論對(duì)大莖點(diǎn)霉菌菌絲生長(zhǎng)還是孢子萌發(fā)，相對(duì)于無菌水提取液，乙醇提取液均表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用（表1、表2）。

苔蘚植物能夠產(chǎn)生如萜類、黃酮類、脂肪酸等次生代謝產(chǎn)物及一些生物活性物質(zhì)，是潛在的天然活性產(chǎn)物寶庫[5-9]。目前，已有多種苔蘚植物被證明有抑制微生物活性的作用[5-6，8-10]，從苔蘚植物中篩選抗菌、防腐、抗癌、防治心血管疾病、抗凝血和降血脂等藥物將具有廣闊的前景。

本研究初步闡明了多蒴曲尾蘚對(duì)冬棗輪紋病致病菌的抑菌作用，但其抑菌機(jī)制尚不明了。同時(shí)，由于本試驗(yàn)只測(cè)定了

其粗提液的抑菌活性和EC50，對(duì)其抑菌主效成分尚不清楚，仍需圍繞上述問題開展深入研究，為開發(fā)能有效應(yīng)用于冬棗輪紋病生物防治的植物源殺菌劑提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

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