Folin—Ciocalteu法測定濃縮還原橙汁中總酚含量

牛燦杰+陳小珍+張慧+莫衛(wèi)民+王展華+吳雨

摘要：研究福林-酚（Folin-Ciocaileu）法測定濃縮還原橙汁（refrigerated orange juice from concentrated，ROJFC）中總酚含量的最佳反應(yīng)條件，比較不同產(chǎn)地商品100%濃縮還原橙汁中的總酚含量。結(jié)果表明：福林試劑的濃度為 0.25 mol/L、Na2CO3的質(zhì)量分數(shù)為12.5%、反應(yīng)時間為20 min、反應(yīng)溫度為60 ℃時，在0～12 μg/mL范圍內(nèi)，濃縮還原橙汁中多酚含量與其對應(yīng)的吸光度有良好線性關(guān)系（r2=0.998 9），該方法重現(xiàn)性好、精密度高（RSD<2.0%），回收率范圍為99.3%～102.3%;不同產(chǎn)地商品濃縮還原橙汁總酚含量差異較大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。研究結(jié)果為進一步研究濃縮還原橙汁的飲用價值提供了技術(shù)支持與數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：濃縮還原橙汁;福林（Folin-Ciocaileu）法;總酚含量;反應(yīng)條件

中圖分類號： TS275.5 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0291-03

收稿日期：2014-06-05

基金項目：國家科技部質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（編號：201310150）。

作者簡介：牛燦杰（1988—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：ncjlxx@163.com。

通信作者：陳小珍，教授級高級工程師，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：cxz730@163.com。

隨著人們生活水平的提高，果汁的需求量及消費量逐年增長，橙汁則因其口感好、營養(yǎng)豐富等特點成為國際市場上消費量最大的果汁之一。目前，市場上銷售的橙汁主要有濃縮還原橙汁（from concentrated juice，F(xiàn)C）和鮮榨汁（not from contrated juice，NFC），濃縮還原橙汁因其貯存期長、運輸方便、調(diào)配簡單、成本低等優(yōu)點占世界橙汁銷量的75%[1]。濃縮還原橙汁中富含許多對人體有益的組分，如氨基酸、糖、維生素C、微量元素、多酚等，其中多酚類物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，可清除自由基，預(yù)防疾病[2-4]，且與橙汁混濁密切相關(guān)，直接影響橙汁的口感及色澤[5]，因此，濃縮還原橙汁中多酚含量的研究具有重要意義。目前總酚含量的測量方法有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)法[6]、2，2-聯(lián)苯-1-三硝基苯肼（DPPH）測定法[7]、福林（Folin-Ciocalteu）法、FRAP法（Fe3+還原法）[8]、液相色譜法[9-10]等，其中Folin-Ciocalteu法具有操作方便、所用試劑價格低廉、適用于批量檢測等優(yōu)點。但是目前沒有采用 Folin-Ciocalteu 法測定濃縮還原橙汁中多酚含量的標(biāo)準方法，相應(yīng)研究報道也較少，本研究旨在優(yōu)化該法的反應(yīng)條件并將其用于測定不同地區(qū)濃縮還原橙汁中的總酚含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場購買的不同橙汁主產(chǎn)地[11]的濃縮還原橙汁（商品標(biāo)簽標(biāo)注產(chǎn)地分別為巴西、美國、以色列、江西省、四川省、浙江省、天津市、河南省、山東省、廣東省，均標(biāo)明果汁含量≥100%），儲存于-4 ℃?zhèn)溆?沒食子酸標(biāo)準品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;福林試劑，上海荔達生物科技有限公司;牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)樣，賽默飛世爾科技有限公司;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;ABBE-3L折光儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮還原橙汁果汁含量的測定 按GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》測定購買的橙汁果汁含量。結(jié)果表明，濃縮還原橙汁的果汁含量測定值與標(biāo)簽標(biāo)注值相符。

1.2.2 比色條件的選擇 配制一系列濃度梯度（0.10、015、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林試劑及質(zhì)量分數(shù)梯度（7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液。吸取0.5 mL巴西產(chǎn)濃縮還原橙汁至50 mL比色管中，加入25 mL蒸餾水，搖勻，再加入5 mL一定濃度的福林試劑、10 mL一定質(zhì)量分數(shù)的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至50 mL，分別在一定溫度梯度（20、40、60 ℃）下反應(yīng)，測定不同反應(yīng)時間（10、20、40、60、80 min）下在760 nm處的吸光度。

1.2.3 福林試劑最優(yōu)濃度的選擇 取巴西產(chǎn)濃縮還原橙汁0.5 mL，Na2CO3溶液的質(zhì)量分數(shù)為12.5%，恒溫水浴溫度為60 ℃，反應(yīng)時間20 min，取 5 mL不同濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林試劑，按“1.2.2”節(jié)的試驗方法，測定體系在760nm處的吸光度。

1.2.4 Na2CO3溶液質(zhì)量濃度的選擇 取巴西產(chǎn)濃縮還原橙汁0.5mL，福林試劑的濃度為0.25 mol/L，恒溫水浴溫度為 60 ℃，反應(yīng)時間20 min，取10 mL不同質(zhì)量分數(shù)（7.5%、100%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液，按“122”節(jié)的試驗方法，測定體系在760nm處的吸光度。

1.2.5 反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度的選擇 取巴西產(chǎn)濃縮還原橙汁0.5 mL，福林試劑的濃度為0.25 mol/L，Na2CO3溶液的質(zhì)量分數(shù)為12.5%，改變溫度梯度及反應(yīng)時間，在760nm處測定吸光度。

1.2.6 標(biāo)準曲線的建立 分別準確移取0、1、2、3、4、5、6 mL濃度為100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準溶液于50 mL比色管中，制得濃度分別為0、2、4、6、8、10、12 μg/mL的系列標(biāo)準溶液，各加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林試劑，充分搖勻后，各加入10 mL 12.5%的碳酸鈉溶液，定容，60 ℃水浴 20 min，760 nm波長下比色，以總酚含量（以沒食子酸計）為橫坐標(biāo)、吸光度（D760 nm）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準曲線。endprint

1.2.7 精密度試驗 室溫條件下，準確移取6份3.0 mL沒食子酸標(biāo)準溶液，按照“1.2.2”節(jié)的方法測定總酚含量，計算RSD值。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 室溫條件下，取同一濃縮還原橙汁 0.5 mL 至50 mL比色管中，加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林試劑、10 mL 12.5%碳酸鈉溶液，混合均勻后定容至50 mL，60 ℃水浴20 min，分別在反應(yīng)時間為30、60、90、120、150、180 min時于760 nm處測定其對應(yīng)總酚含量，并計算RSD值。

1.2.9 加標(biāo)回收率試驗 室溫下取0.5 mL巴西產(chǎn)濃縮還原橙汁至50 mL比色管中，按照“1.2.2”節(jié)的方法測定其總酚含量作為本底量;再分別移取0.5 mL同一濃縮還原橙汁至3個比色管中，各加入0.5、1.0、1.5 mL的100 μg/mL標(biāo)準溶液后按照“1.2.2”節(jié)的方法測定總酚含量，并計算回收率。

1.2.10 樣品總酚含量的測定 在選擇出最優(yōu)比色條件后，分別準確移取0.5 mL的樣品溶液至50 mL比色管中，按“122”節(jié)的方法測定不同產(chǎn)地濃縮還原橙汁的總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色條件的選擇

2.1.1 福林試劑最優(yōu)濃度的選擇 由圖1可得，在0.10～0.40 mol/L內(nèi)，隨福林試劑濃度增大，D760 nm逐漸增大。在濃度小于0.25 mol/L時D760 nm增加顯著;在濃度大于 0.25 mol/L 時，D760 nm變化較小且趨于平衡。因此，按照“反應(yīng)靈敏度高、節(jié)約試劑”的原則，選擇0.25 mol/L的福林試劑。

2.1.2 Na2CO3溶液質(zhì)量分數(shù)的選擇 由圖2可知，碳酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)為7.5%～12.5%范圍內(nèi)，隨著碳酸鈉濃度的增大，吸光度隨著增加;當(dāng)碳酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)大于125%時，隨碳酸鈉溶液質(zhì)量分數(shù)的增大，吸光度減小。因此選用12.5%的碳酸鈉溶液。

2.1.3 反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度的選擇 由圖3可得，反應(yīng)溫度為20、40、60 ℃，反應(yīng)時間分別為60、40、20 min時，D760 nm達到平衡，D760 nm分別為0.613 2、0.612 7、0.617 4。按照“靈敏度高、反應(yīng)時間短”的原則，選擇反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為20 min。

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 標(biāo)準曲線的建立 結(jié)果表明，在0～12 μg/mL濃度范圍內(nèi)，沒食子酸的含量與D760 nm線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.069 4x-0.004 3（r2=0.998 9）。建立標(biāo)準曲線如圖4所示。

2.2.2 精密度試驗 精密度試驗結(jié)果表明，總酚吸光度的RSD為1.09%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 不同反應(yīng)時間下的RSD值為2.02%，表明穩(wěn)定性好。

2.2.4 加標(biāo)回收率試驗 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率結(jié)果

序號 本底量

（μg） 加標(biāo)量

（μg） 測定的總量

（μg） 回收率

（%）

1 445.14 50 495.29 100.3

2 444.58 50 493.63 98.1

3 443.15 50 493.00 99.7

1～3平均〖5〗99.4

4 444.49 100 546.99 102.5

5 442.99 100 545.79 102.8

6 445.03 100 546.53 101.5

4～6平均〖5〗102.3

7 445.55 150 594.65 99.4

8 446.77 150 596.02 99.5

9 446.09 150 594.74 99.1

7～9平均〖5〗99.3

2.2.5 干擾試驗 采用福林試劑測定橙汁多酚時，橙汁中的本底蛋白質(zhì)含量可能會產(chǎn)生干擾，根據(jù)相關(guān)文獻報道，橙汁中蛋白質(zhì)含量約為82 μg/mL[12]，取0.5 mL 100 μg/mL牛血清蛋白質(zhì)溶液，按“1.2.2”節(jié)方法測得760 nm處的D760 nm為0019;同樣條件下，橙汁中總酚的D760 nm大于0.5，因此蛋白質(zhì)的影響可以忽略。

2.2.6 濃縮還原橙汁中總酚含量的測定 由圖5可知，不同地區(qū)商品濃縮還原橙汁總酚含量相差較大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。

3 結(jié)論

本研究采用Folin-Ciocalteu法測定濃縮還原橙汁中總酚含量，確定了反應(yīng)的最佳條件，該方法具有穩(wěn)定性好、精密度高、操作簡便、省時、不受蛋白質(zhì)的干擾等優(yōu)點，為濃縮還原橙汁中總酚含量的研究提供技術(shù)支持。對不同產(chǎn)地商品濃縮還原橙汁中總酚含量的測定發(fā)現(xiàn)，總酚含量相差很大，為濃縮還原橙汁的飲用價值研究提供了理論依據(jù)。

致謝：感謝莫衛(wèi)民老師及陳小珍老師在論文選題方面給予的指導(dǎo)，張慧博士在論文寫作方面給予的意見，以及王展華、裴華2位同事在試驗過程中給予的幫助。

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