多毛番茄冷誘導轉錄因子CBF1轉化番茄的研究

王沛文+朱文哲+劉陽+李景富+陳宏宇+陳秀玲+王傲雪

摘要：番茄在氣溫低于12 ℃時即不能正常開花結實，因此番茄生產(chǎn)受到了很大限制。多毛番茄是一種野生番茄，具有耐低溫甚至抗凍的特性，短暫遭受0 ℃的低溫，仍能正常開花結實。構建了多毛番茄冷誘導轉錄因子CBF1的植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導法轉入番茄中，獲得8株轉基因陽性植株。轉基因植株經(jīng)冷誘導處理后，丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（ O-2 · ）含量均低于非轉基因對照，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性則高于非轉基因對照，表明轉多毛番茄CBF1基因（ShCBF1）可以提高番茄的抗冷性。

關鍵詞：多毛番茄;CBF1轉錄因子;耐冷性;番茄;遺傳轉化

中圖分類號：S641.201 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0030-06

收稿日期：2014-05-23

基金項目：國家自然科學基金青年項目（編號：31301780）;教育部科學技術研究重點項目（編號：211043）;黑龍江省博士后基金（編號：LBH-Z12044）;黑龍江省高校寒地蔬菜生物學重點實驗室開放課題基金（編號：CVB2012-005）。

作者簡介：王沛文（1990—），男，內蒙古人，碩士，從事蔬菜分子生物學方面的研究。E-mail：1009934259@qq.com。

通信作者：王傲雪，博士，教授，從事植物分子生物學方面研究。E-mail：wangaoxue@yahoo. com。

番茄是一種重要的蔬菜作物，在世界各地均有栽培，但在生產(chǎn)過程中，經(jīng)常遭受低溫冷害，因而降低了經(jīng)濟效益，影響番茄生產(chǎn)。而多毛番茄是一種野生番茄，屬番茄屬[1]，相關研究表明，它具有耐低溫甚至抗凍的特性[2]。多毛番茄葉片表面有厚密的絨毛，而普通番茄不具備此特點，推測多毛番茄表面的絨毛可能在一定程度上提高了其耐冷能力[3]。然而多毛番茄只有作父本和栽培番茄雜交才能坐果，而且果實結籽率低，轉育雜交困難[4]，限制了其作為育種材料的應用。多毛番茄的高耐冷性不僅與膜脂相變程度小、膜結構的調整能快速適應低溫、代謝調整等一些生理生化變化有關[5]，同時也受CBF1基因的誘導[6]。

CBF（CRT/DRE binding factor）基因是一種抗冷（凍）轉錄因子，CBF基因首先在擬南芥中被克隆出來[7]。該基因通過調動一系列的冷害相關（COR）基因完成植株的抗冷機制[8]。對多毛番茄而言，它的CBF1基因與普通番茄的CBF1基因同源性很高，但是普通番茄為冷敏植物，不具備耐冷性，多毛番茄耐冷性卻很強。推其原因，可能是多毛番茄CBF1基因下游的耐冷相關基因的分布和普通番茄不同，導致多毛番茄CBF1基因對下游基因的調控作用強于普通番茄。

在擬南芥中過量表達CBF1基因，植株的抗寒能力明顯提高，不僅能提高COR蛋白的含量，而且大幅提高可溶性糖和脯氨酸含量[9-11]。Hsieh等將擬南芥的CBF1基因轉入番茄后，使番茄植株的CAT活性增強、脯氨酸含量增加，在干旱條件下比野生番茄植株表現(xiàn)更強的抗旱能力[12]。本研究從具有強抗冷性的野生番茄中克隆得到的CBF1轉錄因子通過農(nóng)桿菌介導法轉入到番茄中，并探討了轉基因植株的抗冷性及生理生化變化，獲得了抗寒力增強的番茄新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多毛番茄LA1033來自番茄遺傳資源中心（tomato genetic resource center，TGRC），普通番茄Micro-Tom由東北農(nóng)業(yè)大學番茄課題組提供。

1.1.2 菌株和質粒 PMD18-T載體購自TaKaRa公司（大連）。植物表達載體p（h+p）由東北農(nóng)業(yè)大學生物工程實驗室饋贈，大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌EHA105由東北農(nóng)業(yè)大學番茄課題組提供。

1.1.3 主要試劑 各種限制性內切酶購于大連TaKaRa公司，T4連接酶、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）購自 Promega 公司;質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，其他試劑均國產(chǎn)分析純試劑。

番茄再生體系利用現(xiàn)有的成熟體系，具體如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物及PCR反應條件 根據(jù)筆者所在實驗室已經(jīng)克隆的多毛番茄LA1033的CBF1基因序列（GenBank 登錄號GU129699）設計特異引物，在引物兩端添加適當?shù)拿盖形稽c，便于載體構建。引物設計應用primer 5.0軟件進行，合成由上海生物工程有限公司完成。ShCBF1up為5′-GT GGATCCACCATGAATATCTTCGAAACC-3′（斜體為BamHⅠ酶切位點），ShCBF1down為5′-GCGGTACCTTAGATGGAATAATTCC-3′（斜體為KpnⅠ酶切位點）。

表1 番茄Micro-Tom的再生體系

培養(yǎng)基 成分

無菌苗培養(yǎng)基A O+15 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂（pH=5.8）

預培養(yǎng)培養(yǎng)基B O+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1.0 mg/L BAP+1.0 mg/L NAA（pH=5.8）

共培養(yǎng)培養(yǎng)基C O+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1.0 mg/L BAP+1.0 mg/L NAA（pH=5.8）

芽誘導培養(yǎng)基D O+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+2 mg/L Zeatin*+500 mg/L Cef+50 mg/L Km（pH=5.8）

芽伸長培養(yǎng)基E O+15 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+1.0 mg/L Zeatin+500 mg/L Cef+50 mg/L Km+1.0 mg/L GA（pH=5.8）

生根培養(yǎng)基 F O+15 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2.0 mg/L IBA+500 mg/L Cef+50 mg/L Km+1.0 mg/L GA（pH=5.8）

注：*前2周用2 mg/L Zeatin，以后Zeatin的濃度減半;O為4.3 g/L MS。

以多毛番茄LA1033葉片總RNA逆轉錄得到的cDNA第一鏈為模版，引物ShCBF1up和ShCBF1down進行PCR擴增，PCR體系為20 μL：含有2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL Mg2+（25 mmol/L），0.4 μL dNTP （10 mmol/L），上下游引物各1 μL （10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL模板cDNA，12.8 μL ddH2O。反應條件：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35次循環(huán);最后72 ℃，保溫10 min，反應產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 ShCBF1表達載體的構建 將PCR擴增得到的ShCBF1經(jīng)膠回收純化后與PMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，利用熱激法轉化大腸桿菌，涂板后37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取白斑進行PCR初篩和質粒酶切鑒定，得到含有ShCBF1基因的陽性克隆。將鑒定為陽性克隆的轉化子（PMD-1033CBF1）送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，以驗證目標基因的準確性。

ShCBF1植物表達載體基于載體p（h+p）進行構建，首先合成接頭adapter1（5′-CGTACGTGAGCT- 3′）和adapter2（5′-CATGGCATGCAC 3′），adapter1和adapter2在65 ℃下孵育10 min后，可形成1個兩端分別是KpnⅠ和SacⅠ酶切位點的黏性末端的接頭。該接頭在T4連接酶的作用下與其他片段進行連接反應。利用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切PMD-1033CBF1質粒，得到ShCBF1基因。用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒p（h+p），回收10 kb左右的載體片段。將目的基因、載體片段及合成好的接頭用T4連接酶進行連接、轉化大腸桿菌DH5α，將轉化細胞涂布于含有Km抗性的LB培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR初步檢測，并做好標記。然后在PCR成功的單菌落處再挑1次搖菌，提取質粒DNA，用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒。鑒定重組體中ShCBF1基因片段插入的正確性，將得到的重組質粒命名為pCAMhp1033CBF1。凍融法將質粒pCAMhp1033CBF1導入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，PCR檢測后待用。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導番茄的遺傳轉化 無菌苗獲得：將番茄品種Micro-Tom的種子經(jīng)挑選后，用70%無水乙醇浸泡30 s，然后用10%次氯酸鈉（NaClO）消毒15 min，其間不斷搖動，再用無菌水清洗3～4次后，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶15～20粒，置于（26±2） ℃（16 h光照，8 h黑暗）培養(yǎng)，光照度 1 600～1 800 lx。待子葉展開時，在無菌條件下切下子葉放在B培養(yǎng)基中預培養(yǎng)24 h，即可用于農(nóng)桿菌侵染。

農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取YEP平板上的單菌落，接種于10 mL含相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，菌液長至D600 nm=0.5左右時，按1 ∶ 10的比例稀釋菌液，再搖菌進行二次活化，搖約8～10 h至菌液D600 nm=0.5左右時，將菌液轉入離心管，然后4 ℃、4 000 r/min離心 10 min，收集細菌細胞，用2%MSO液體培養(yǎng)基懸浮沉淀至D600 nm=05，該菌液作為轉化用菌液，對番茄葉片外植體進行侵染。

侵染和共培養(yǎng)：將外植體放入已用2%MSO液體培養(yǎng)基懸浮好的菌液侵染預培養(yǎng)24 h的子葉20 min，其間輕輕搖動，浸染完之后將番茄葉盤背面向上放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基C中共培養(yǎng)48 h。

外植體的篩選：外植體篩選利用卡那霉素，篩選壓力為50 mg/L，設對照為未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的子葉外植體放置到D培養(yǎng)基中，這些子葉應該被卡那霉素殺死。已侵染的并共培養(yǎng)48 h的外植體也轉移置D培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。

外植體的繼代：每隔2周將D培養(yǎng)基中的外植體繼代1次，在此期間葉原基大概在2周內就形成了，將形成葉原基的外植體切成小塊轉移到E培養(yǎng)基中，每隔2周或間隔更短時間繼代1次。經(jīng)過2～3周E培養(yǎng)基的繼代和篩選。3種類型的繼代外植體被區(qū)分出來并分別轉入不同的培養(yǎng)基：具有1 cm長的形狀良好的芽的外植體轉移置E培養(yǎng)基中;致密的、綠色的外植體（有或沒有綠色的原基和小的不定芽）轉到含1 mg/L玉米素的D培養(yǎng)基;黑色或棕色的外植體已被卡那殺死，組織疏松的白色的外植體沒有分生能力，這2種外植體都應丟棄。

生根培養(yǎng)和馴化移栽：當芽長置2～4 cm時切離外植體，轉到生根培養(yǎng)基F中。植株長到5 cm可馴化移栽到土中。將轉基因植株從三角瓶中取出，用自來水洗掉植株根部的瓊脂，然后移栽到裝有濕潤土壤的營養(yǎng)缽中。再把營養(yǎng)缽放在淺盤中用自來水充分浸透營養(yǎng)缽中的土壤。將淺盤用透明的塑料膜罩上，以保證較高的濕度。5～7 d后撤掉塑料膜，施水肥，植株長置10 cm定植到溫室。

1.2.4 轉化植株的PCR檢測 CTAB法提取轉化獲得的番茄幼苗的基因組DNA，根據(jù)NptⅡ序列設計引物NptⅡup 5′-ACTGGGCACAACAGACAA-3′和NptⅡdown 5′-CCGTAAAGCACGAGGAA-3′。以基因組DNA模板、NptⅡ上下游引物進行PCR擴增，以未轉基因的番茄植株為陰性對照，質粒為陽性對照。

1.2.5 轉基因植株的耐低溫性檢測 低溫對植物造成的影響主要是對植物細胞的生理生化特性產(chǎn)生影響，比如細胞的膜脂過氧化作用、細胞抗氧化酶系統(tǒng)以及細胞的脂類物質發(fā)生變化等。為了初步檢測轉基因植株的耐低溫性，選取陽性的轉ShCBF1植株和對照植株的幼苗，置于人工氣候室內培養(yǎng)，22～25 ℃、光照16 h/d，在6張真葉時用于低溫脅迫處理。將轉基因植株株系TS-1、TS-2植株和對照植株（CK）在5 ℃條件下處理，分別在處理后0、24、36、48、96、144 h取樣，測定并分析轉基因植株與對照植株間的丙二醛（MDA）含量、超氧自由基（ O-2 · ）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量和過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性等各項指標。測定方法參照朱文哲等的方法（2011），同時比較轉基因與為轉基因植株的形態(tài)特征。

2 結果與分析

2.1 多毛番茄CBF1基因的pCAMhp1033載體構建

用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒PMD-1033CBF1，回收700 bp左右的1033CBF1基因片段，同時，用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質粒p（h+p），回收10 kb左右的載體片段（圖1）。將這2個片段與已連接好的KpnⅠ、SacⅠ接頭一起用T4連接酶連接并轉化。

經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定，均得到預期目的片段，證明植物表達載體pCAMhp1033CBF1構建成功（圖2）。

2.2 植物表達載體pCAMhp1033轉化農(nóng)桿菌

采用凍融法將已構建好的植物表達載體pCAMhp1033導入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，涂布在含有Rif和Km的YEP固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后長出菌落，隨機挑取菌落進行ShCBF1基因的PCR擴增，電泳結果可以看出，轉化的菌落可擴增出約700 bp左右特異的目的基因片段（圖3），表明得到了完整的Ti質粒表達載體系統(tǒng)。因為直接提取農(nóng)桿菌質粒進行酶切鑒定比較困難，所以，將提取的PCR檢測具有目的條帶的農(nóng)桿菌質粒轉化入大腸桿菌，再提取大腸桿菌質粒進行酶切鑒定，如圖4所示，表明pCAMhp1033已成功轉入農(nóng)桿菌菌株EHA105。

2.3 番茄的遺傳轉化

通過對番茄子葉進行遺傳轉化，最終得到抗性植株13株，番茄品種Micro-Tom的遺傳轉化過程見圖5。

2.4 再生植株的PCR檢測

利用NptⅡ序列對轉基因植株進行PCR檢測，以質粒為陽性對照，以未轉基因植株為陰性對照，擴增結果如圖6所示?？剐灾仓暧?3株，8株表現(xiàn)為陽性。這初步說明1033CBF1目的基因整合到Micro-Tom的番茄基因組中。

2.5 轉基因植株的耐低溫性檢測

2.5.1 低溫脅迫對轉化植株的MDA和 O-2 · 含量的影響 在非低溫脅迫條件下，轉基因植株與對照植株之間的MDA、

O2-含量無明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時間延長，轉基因植株和對照植株的MDA、 O-2 · 含量逐漸升高，而對照植株比轉基因植株升高趨勢快且顯著高于轉基因植株，轉基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，由此可見轉基因植株的細胞膜傷害程度比非轉基因植株輕（圖7-A、圖7-B）。

2.5.2 低溫脅迫對轉化植株的SOD和POD活性的影響 隨著5 ℃低溫脅迫時間的延長，轉基因植株與對照植株的SOD活性在72 h時出現(xiàn)了一個峰值，在0～72 h之間呈上升趨勢，之后下降。而POD活性均呈上升趨勢，轉基因株系 TS-1 和TS-2之間無明顯差異，且顯著高于對照植株（圖 7-C、圖7-D）。

2.5.3 低溫脅迫對轉化植株的脯氨酸（Pro）含量和CAT活性的影響 在非低溫脅迫條件下，轉基因植株與對照植株之間的脯氨酸含量無明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時間的延

長，轉基因植株和對照植株的脯氨酸含量均表現(xiàn)為上升趨勢，轉基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，但明顯高于對照（圖 7-E）。由于研究表明脯氨酸含量與植物抗寒性有很大相關性，說明轉基因植株的耐冷性更強。隨著5 ℃低溫脅迫時間延長，轉基因株系TS-1和TS-2的CAT活性呈上升趨勢，而對照植株則呈下降趨勢（圖7-F）。

2.5.4 低溫脅迫對轉化植株的ASA和PAL活性的影響 在非低溫脅迫條件下，轉基因植株與對照植株之間的ASA和PAL活性無明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時間延長，轉基因植株和對照植株的ASA、PAL活性逐漸下降，轉基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，但明顯高于對照（圖7-G、圖7-H）。

2.5.5 轉基因植株的形態(tài)觀察 低溫脅迫后，轉基因植株生長未受影響，而非轉基因植株生長受到一定抑制，轉基因植株比非轉基因植株高，葉色濃綠，而非轉基因植株的葉色要明顯比轉基因植株的淺，呈現(xiàn)淡綠色，且有一定程度的萎蔫（圖8）。

3 結論與討論

番茄是一種極具營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值的世界性蔬菜作物[13]，而冷（凍）害常會嚴重影響其產(chǎn)量。低溫脅迫嚴重影響著植物的生長發(fā)育，番茄在溫度低于12 ℃時就不能正常開花結果和生長發(fā)育[14]，在0～12 ℃之間，植株表現(xiàn)出冷害，損傷程度受到低溫脅迫時間的影響。多毛番茄是一種野生番茄，具有耐低溫甚至抗凍的特性。本研究成功構建了多毛番茄的冷誘導轉錄因子CBF1的植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導法獲得了番茄的轉ShCBF1植株，豐富了抗寒番茄轉基因新種質。

ROS（ O-2 · 、H2O2、·OH）是植物體有氧代謝不可避免的產(chǎn)物，會引發(fā)生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生膜脂過氧化反應，并由此產(chǎn)生對細胞有毒性的脂質過氧化物，在低溫脅迫時，植物體自由基增加，使質膜過氧化作用加強，導致膜的損傷和破壞。本研究中轉基因植株經(jīng)冷誘導處理后，丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（ O-2 · ）含量均低于非轉基因對照，證明了轉ShCBF1基因植株對低溫脅迫的耐受性增強，增加了自身的抗寒性。

低溫脅迫下，轉基因株系中超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過氧化氫酶

（CAT）活性、 抗壞血酸過氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解

氨酶（PAL）活性則高于非轉基因對照。SOD主要的功能是清除 O-2 · ，產(chǎn)生H2O2[15-17]。而CAT能夠在低溫脅迫過程中清除SOD產(chǎn)生的H2O2[18]，維持體內活性氧代謝平衡，保護膜結構，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗低溫脅迫。低溫脅迫時間的延長誘導POD酶活性的增強，從而抵御低溫下氧自由基的傷害。適當?shù)木S持體內膜保護酶活性和 O-2 · 含量的平衡關系。由于冷誘導基因CBF1主要受冷誘導表達，因此，在冷脅迫下植株內SOD活性增減可能是CBF1基因在低溫逆境誘導下超量表達，在一定程度上使得其自身有效清除體內超氧離子的能力增強。

此外，在低溫脅迫條件下，自由基的不斷積累會破壞ASA和PAL對活性氧的毒害防御作用。而轉基因植株可能其本身耐冷基因CBF1受冷誘導后超量表達，增強了其耐冷機能。使轉基因植株的ASA和PAL活性顯著高于對照植株。冷脅迫后生理生化指標的測定和植株形態(tài)觀察充分表明了轉ShCBF1基因可以提高番茄的抗冷性。

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