蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測

劉鈺嬌+楊金鳳+趙璐+王亞南+胡同樂+王樹桐+曹克強

摘要：蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì)，嚴重影響基因組DNA提取的得率和純度。采用3種不同方法，即改良的CTAB法、快速鹽提法、試劑盒法，從蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部提取基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測所提取基因組DNA的質(zhì)量。結果表明，改良的CTAB法提取的組織基因組DNA不論是濃度、質(zhì)量還是隨機引物PCR擴增效果均能夠滿足進一步分子試驗需要，而改進的快速鹽提法和試劑盒法提取得率太低，不能用于分子生物學研究。因此改良的CTAB法是適合蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA提取的最佳方法。

關鍵詞：蘋果;韌皮部;木質(zhì)部;基因組DNA;提取

中圖分類號： S436.611 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0036-03

收稿日期：2014-06-25

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科技專項（編號：201203034、200903004）;國家蘋果現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術體系項目（編號：CARS-28）。

作者簡介：劉鈺嬌（1988—），女，河北無極人，碩士研究生，主要從事植物病害流行與綜合防治研究。Tel：（0312）7520192;E-mail：liuyujiaolong@126.com。

通信作者：王亞南，女，博士，副教授，主要從事分子植物病理學研究。Tel：（0312）7528157;E-mail：wyn3215347@163.com。

蘋果屬于薔薇科（Rosacea）仁果亞科（Pomoidea）蘋果屬（Malus Mill.）植物，在我國有悠久的栽培歷史。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2012年，我國蘋果栽培面積達到206萬hm2，產(chǎn)量3 700萬t，我國已經(jīng)成為世界上最大的蘋果生產(chǎn)國[1]。我國蘋果上的枝干病害如蘋果樹腐爛病、輪紋病等嚴重影響蘋果樹的生長及產(chǎn)量，從分子水平研究枝干病害對病害的正確診斷、病菌的分布以及有效防治策略的制定有十分重要的意義。植物DNA的提取方法在很多文獻中都有大量報道[2-5]，而蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì)，嚴重影響基因組DNA提取的得率和純度。本試驗對改良的CTAB法、快速鹽提法、試劑盒法這3種提取總DNA的方法進行比較分析，試圖確立適于蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部基因組DNA提取的最佳方法，以便于進行枝干病害的分子生物學研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘋果木質(zhì)部及韌皮部材料采自河北農(nóng)業(yè)大學植物病害流行與綜合防治試驗園，分別取富士蘋果樹的主干、1年生枝條、2年生枝條和3年生枝條的木質(zhì)部及韌皮部，放入保鮮袋中并盡快帶回實驗室，放于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 改良的CTAB法[6] 將樣品加入適量的石英砂，加液氮研磨，取適量植物組織粉狀裝入2 mL無菌的離心管中備用。向離心管中加入65 ℃預熱的2% CTAB 抽提緩沖液[14 mol/L NaCl，1 mol/L Tris-HCL（pH值8.0），20 mmol/L EDTA，2% CTAB，2% PVPP，2%β-巰基乙醇]650 μL，渦旋混勻，65 ℃水浴1 h，每隔10 min輕輕顛倒離心管1次，使研磨后的粉末和抽提緩沖液充分混勻。向離心管中加入 650 μL 的酚-氯仿-異戊醇（體積比25 ∶ 24 ∶ 1），渦旋混勻，并于4 ℃、12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移至一個新的離心管中，向其中加入等體積的氯仿混均勻，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液轉移至另一新的離心管中，向其中加入60 μL的3 mol/L NaAc，和200 μL異丙醇，混合均勻，-20 ℃放置1 h，12 000 r/min離心10 min，倒出上清液。用300 μL冷凍保存70%乙醇清洗沉淀2次，無水乙醇沖洗1次，最后于室溫條件下干燥，向離心管中加入 100 μL TE（pH值8.0），4 ℃放置過夜待DNA完全溶解，于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 改進的快速鹽提法[7] 在樣品中加入適量的石英砂，加液氮研磨，取適量粉狀植物組織裝入2 mL無菌的離心管中備用。每管加入提取緩沖液（1.0 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0），50 mmol/L EDTA（pH值8.0）400 μL，用塑料棒旋轉碾碎后加40 μL 20%SDS，振蕩混勻30 s。將樣品放于65 ℃水中溫育2 h，向每管加入300 μL 6 mol/L NaCl，振蕩混勻30 s。12 000 r/min離心10 min，將上清轉入干凈的離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，輕柔混勻后-20 ℃冰箱放置1 h。12 000 r/min離心10 min，小心將上清液倒出，分別用70%乙醇和純乙醇各洗1次后，晾干。將DNA樣品溶解于100 μL滅菌的蒸餾水中，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 試劑盒法 采用植物組織基因組DNA提取試劑盒（Easy Pure Plant Genomic DNA Kit，北京全式金生物公司）進行木質(zhì)部和韌皮部組織基因組DNA的提取，嚴格按照試劑盒說明書上提供的方法進行操作，最后提取的基因組DNA于-20 ℃ 保存，備用。

1.3 DNA的質(zhì)量檢測

1.3.1 DNA濃度的測定和純度檢測 采用K5500超微量紫外分光光度計進行濃度測定及純度檢測。DNA樣品的濃度一般可根據(jù)其在260 nm的吸光度來確定，純度檢測通過D260 nm/D280 nm來確定。

1.3.2 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測 分別取5 μL DNA樣品和1 μL的6×Loading buffer，混勻后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測使用Marker為寶生物工程（大連）有限公司的DL2000 DNA Marker，電泳電壓為110 V，時間為 40 min。電泳結束后進行溴化乙錠（EB）染色，最后經(jīng) SYNGENE 凝膠成像儀觀察照相。

1.3.3 隨機引物PCR擴增 隨機引物擴增反應使用30 μL反應體系（2×EsTaq MasterMix 15 μL，引物1 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 13 μL）。其中，隨機引物為上海生工生物工程技術服務有限公司2 000多條引物中隨機挑選的1條。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 DNA濃度的測定和純度檢測

由表1可以看出，改良的CTAB法提取DNA的濃度基本能滿足PCR要求，而改進的快速鹽提法和試劑盒法提取效果很差，提取DNA得率太低或無法提出，因而無法進行后續(xù)的分子生物學試驗。從表2可以看出，改良的CTAB法提取DNA的D260 nm/D280 nm為2.06～2.29，這表明DNA受損程度不高且比較純，蛋白質(zhì)、酚類及多糖等雜質(zhì)去除效果較好，但 D260 nm/D280 nm 大于1.9，表明可能有RNA，要求嚴格的分子生物學試驗可以加一步去除RNA的操作。改進的快速鹽提法和試劑盒法提取DNA的D260 nm/D280 nm均小于1.6，甚至有的為負數(shù)，這表明蛋白質(zhì)或酚類污染嚴重，或是未提出DNA。綜上，改良的CTAB法是適合蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA提取的最佳方法。

表1 蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織提取DNA濃度檢測

組織部位

提取的DNA濃度（ng/μL）

改良的CTAB法 改進的快速鹽提法 試劑盒法

木質(zhì)部 韌皮部 木質(zhì)部 韌皮部 木質(zhì)部 韌皮部

主干 102.1 256.6 12.0 16.2 3.3 7.5

3年生枝條 178.4 376.5 34.9 46.7 4.4 11.2

2年生枝條 228.5 566.2 42.6 69.2 1.6 9.5

1年生枝條 418.2 734.5 92.3 97.7 8.2 18.9

表2 蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織提取DNA純度檢測

組織部位

D260 nm/D280 nm

改良的CTAB法 改進的快速鹽提法 試劑盒法

木質(zhì)部 韌皮部 木質(zhì)部 韌皮部 木質(zhì)部 韌皮部

主干 2.29 2.23 1.6 1.0 0.8 0.97

3年生枝條 2.11 2.06 0.5 0.5 1.2 -3.70

2年生枝條 2.15 2.12 1.1 0.5 0.6 1.10

1年生枝條 2.10 2.09 1.3 0.6 1.4 1.30

2.2 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測

從圖1可以看出，用改良的CTAB法提取的組織基因組DNA可以看到均有大于2 000 bp的條帶，但條帶亮度均比Marker要暗，說明所提基因組DNA濃度均偏低，從條帶亮度也大致可以看出主干的木質(zhì)部以及韌皮部的基因組DNA提取質(zhì)量低于枝條組織;而改進的快速鹽提法以及試劑盒法提取的基因組DNA均未有明顯條帶，有的泳道可以隱約看到條帶，說明提取質(zhì)量太差或未成功提取到。

2.3 隨機引物PCR擴增

從圖2可以看出，用改良的CTAB法提取的蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA進行隨機引物的PCR反應獲得了清晰穩(wěn)定的條帶，進行重復試驗，均獲得了較好的擴增，表明該方法提取的基因組DNA適合進一步的分子分析。從圖3可以看出，改進的快速鹽提法提取的組織基因組DNA進行隨機引物的PCR反應，部分組織也獲得了條帶，但條帶模糊且重復性不好，因而不太適合進一步的分子分析。從圖4可以看出，試劑盒法提取的組織基因組DNA進行的隨機引物PCR反應均未獲得任何條帶，表明此方法可能未提取到DNA。

3 討論

高質(zhì)量DNA要求盡量保持核酸分子完整性、高分子量，無明顯降解現(xiàn)象;還要求純度高，盡量去除酚類等嚴重干擾酶作用的雜質(zhì);此外要求獲取效率高，能夠達到試驗要求的濃度[8]。蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì)，嚴重影響基因組DNA提取的得率和純度。CTAB提取液中加入的PVPP具有酰胺鍵，可吸附多酚分子上的氫氧基從而形成氫鍵，可以吸附多酚，其中加入的β-巰基乙醇是一種還原劑，可防止細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生褐變，因此，本試驗采用的改良的CTAB法獲得了較好的提取效果，此外泳道下邊無拖尾，無小片段產(chǎn)物，說明未有RNA污染，這可能是因為提取完DNA后未及時進行電泳檢測，RNA可能已經(jīng)降解。改進的鹽提法中加入的1.0 mol/L NaCl在減少DNA降解的同時可以清除嚴重降解的DNA[9];EDTA可以螯合金屬離子，酶不能與金屬離子結合，否則就失去了活性，核酸酶類也是如此，所以EDTA可避免提取DNA時核酸酶類污染造成DNA的降解。但該方法依舊未獲得高質(zhì)量的DNA，雖避免了使用酚/氯仿抽提，減少了酚/氯仿對試驗人員的傷害，但提取效果不佳，不建議使用該方法進行蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部的基因組DNA提取。試劑盒法為公司開發(fā)的便捷型產(chǎn)品，對一般植物組織可能通用性較強，但是對于蘋果樹的木質(zhì)部和韌皮部針對性太差，無法提取到高質(zhì)量的基因組DNA。

楊英軍等采用CTAB法和SDS法從落葉果樹韌皮部提取DNA，認為SDS法總體上優(yōu)于CTAB法[10]，但王富榮等[11]以及王飛等[12]分別采用CTAB法提取桃韌皮部DNA和果梅休眠枝韌皮部DNA均獲得了良好的提取效果，這可能是因為不同的果樹組織中的代謝產(chǎn)物有差別。本試驗采用3種不同的提取方法進行比較，最終確定改良的CTAB法是較適合蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA提取的方法，但是該方法所采用的試劑如β-巰基乙醇、酚/氯仿等均對人體有輕微傷害，因此在提取DNA過程中，一定要注意佩戴口罩和手套，盡量減小對試驗人員的傷害。

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