紫杉醇提取方法和曼地亞紅豆杉HPLC指紋圖譜的研究

李乃偉+束曉春+彭峰

摘要：為考察不同提取方法和HPLC檢測(cè)方法對(duì)紫杉醇HPLC檢測(cè)圖譜的影響，采用4種不同提取方法對(duì)曼地亞紅豆杉枝葉中的紫杉醇進(jìn)行粗提，并通過3種不同的HPLC檢測(cè)方法對(duì)粗提物進(jìn)行了檢測(cè)。通過HPLC檢測(cè)圖譜的比較，確立了曼地亞紅豆杉枝葉中紫杉醇的粗提方法和HPLC檢測(cè)方法。色譜條件：色譜柱為Curosil-PFP分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm;流動(dòng)相為乙腈-水溶液梯度洗脫;流速2.6 mL/min;分析時(shí)間70 min;柱溫為30 ℃。

關(guān)鍵詞：紫杉醇;提取方法;HPLC檢測(cè);曼地亞紅豆杉

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0296-03

收稿日期：2014-05-11

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金[編號(hào)：CX（12）2014]。

作者簡(jiǎn)介：李乃偉（1983—），男，山東聊城人，碩士，助理研究員，主要從事生物技術(shù)研究。E-mail：linaiwei8828@163.com。

紫杉醇是紅豆杉屬（Taxus）植物特有的藥物成分，在植物體中含量很低，并與多種類似物共存，而且提取時(shí)常帶有很多色素、樹膠等雜質(zhì)。得率高、重復(fù)性好的提取方法和高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法，是進(jìn)行紫杉醇含量調(diào)控研究的首要條件。目前，已有很多關(guān)于紫杉醇提取純化的報(bào)道[1-4]，然而，這些方法適用于檢測(cè)純度較高的紫杉醇成品和半成品，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用時(shí)存在一定缺陷。國(guó)內(nèi)紫杉醇提取往往采用粗提方法，而不采用成本太高的工藝程序。筆者比較了不同提取方法和不同色譜條件對(duì)紫杉醇粗提液HPLC檢測(cè)的影響，以期篩選一種簡(jiǎn)便提取、精確檢測(cè)紫杉醇的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為江蘇省中科院植物所（南京中山植物園）實(shí)驗(yàn)苗圃內(nèi)引種栽培的曼地亞紅豆杉。11月取樣，采取當(dāng)年生枝條，置于40 ℃烘箱7 d。烘干后粉碎，置于干燥器中密閉保存。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇提取所用試劑均為分析純，HPLC檢測(cè)所用紫杉醇對(duì)照品購(gòu)自安徽爾塔醫(yī)藥科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配成濃度為0.12 mg/mL的溶液。

1.3 提取方法

采用4種不同方法提取樣品材料中的紫杉醇。 （1）精確稱取樣品5 g，甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。將浸提掖濃縮至100 mL后，加等體積正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相濃縮定容至25 mL。 （2）提取過程同方法（1），在正己烷萃取除雜后進(jìn)行C18過柱處理，進(jìn)一步除雜。 （3）提取過程同方法（1），用水代替甲醇浸提，回流溫度為100 ℃，用三氯甲烷代替正己烷進(jìn)行萃取。 （4）提取過程同方法（3），在三氯甲烷萃取除雜后進(jìn)行C18過柱處理，進(jìn)一步除雜。

1.4 紫杉醇HPLC檢測(cè)條件

采用以下3種方法對(duì)紫杉醇粗提液進(jìn)行HPLC檢測(cè)的比較。 （1）參照王文芝的HPLC方法[5]改進(jìn)。采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監(jiān)測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm。選用Kromasil ODS-C18分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱溫 30 ℃，流速0.8 mL/min，流動(dòng)相梯度條件：乙腈 ∶ 水（0.4%磷酸液，pH值3.5）為48 ∶ 52。 （2）完全參照美國(guó)藥典中的HPLC方法[6]。采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監(jiān)測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。選用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速 2.6 mL/min。流動(dòng)相梯度條件，梯度洗脫：0～35 min保持乙腈-水（體積比35 ∶ 65）;35～60 min乙腈從35%升至80%，水從65%降至20%;60～70 min乙腈從80%降回35%，水從20%升回65%;70～80 min，保持乙腈-水（體積比35 ∶ 65）。 （3）參照美國(guó)藥典的HPLC方法進(jìn)行改進(jìn)，采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監(jiān)測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。選用Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流速2.6 mL/min。流動(dòng)相梯度條件：0～35 min保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）;35～60 min乙腈從30%升至50%，水從70%降至50%;60～61 min乙腈從50%降回30%，水從50%升回70%;61～70 min，保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)紫杉醇HPLC檢測(cè)的影響

采用王文芝的HPLC改進(jìn)方法，對(duì)不同方法提取的紫杉醇粗提液進(jìn)行檢測(cè)。圖1至圖4為不同方法的紫杉醇粗提樣品HPLC圖譜。從各圖譜中紫杉醇峰面積的大小可以看出，通過甲醇/正己烷萃取的紫杉醇得率（圖2、圖3）明顯高于氯仿/水（圖4、圖5）提取得率。過柱除雜（圖3、圖5）與未過柱（圖2、圖4）的紫杉醇提取方法，對(duì)HPLC檢測(cè)結(jié)果影響并不顯著。

2.2 不同檢測(cè)方法對(duì)紫杉醇HPLC檢測(cè)的影響

對(duì)通過正己烷/水萃取的未過柱紫杉醇粗提樣品，進(jìn)行3

種不同條件的HPLC檢測(cè)。圖6至圖11顯示了不同檢測(cè)方法對(duì)樣品分離與峰形的影響。3種方法中，參照王文芝的HPLC方法進(jìn)行改進(jìn)的HPLC檢測(cè)圖譜（圖7），各樣品分離效果最差。參考美國(guó)藥典的HPLC檢測(cè)圖譜（圖8、圖9），各樣品分離度高，但進(jìn)樣速度過大，柱壓太高對(duì)分析柱損傷很大。改進(jìn)后的美國(guó)藥典HPLC檢測(cè)方法，流速降低，柱壓減小，檢測(cè)圖譜（圖10、圖11）顯示，雖然出峰時(shí)間延遲，但峰形及分endprint

離度未受影響。采用C18分析柱檢測(cè)的紫杉醇峰面積大于采用五氟苯基Curosil-PFP分析柱檢測(cè)的峰面積（即美國(guó)藥典HPLC方法及其改進(jìn)方法），但是前者圖譜（圖7）的紫杉醇臨近峰數(shù)量少于后者（圖11）。推測(cè)原因是，采用C18分析柱檢測(cè)的方法分離度低，檢測(cè)出的紫杉醇峰可能為重疊峰，該色譜條件下無(wú)法分開一些與紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的化合物。而五氟苯基分析柱及梯度洗脫，可以將化合物結(jié)構(gòu)相近的重疊峰分開。

3 結(jié)論

通過對(duì)不同提取方法與檢測(cè)方法的比較，篩選出曼地亞紅豆杉枝葉粗提紫杉醇的方法為：甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。將浸提液濃縮至100 mL后，加等體積正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相濃縮定容至 25 mL。色譜條件為：采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監(jiān)測(cè)器。選用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流速2.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。0～35 min保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）;35～ 60 min 乙腈從30%升至50%，水從70%降至50%;60～ 61 min 乙腈從50%降回30%，水從50%升回70%;61～ 70 min，保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）。該提取方法和檢測(cè)條件可以用在栽培紅豆杉紫杉醇的含量調(diào)控研究中。

參考文獻(xiàn)：

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[6]The United States Pharmacopeial Convention Inc. United States pharmacopeia/national formulary：USP28-NF23[M]. Philadelphia，USA：National Publishing，2005：1456-1457.endprint