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    高效液相色譜法同時測定鳳仙花中的萘醌類和黃酮類成分

    2015-04-02 07:00:47姜洪芳石寶俊張峰倫趙伯濤施國新張衛(wèi)明
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:萘醌鳳仙花高效液相色譜法

    姜洪芳 石寶俊 張峰倫 趙伯濤 施國新 張衛(wèi)明

    摘要:建立反相高效液相色譜,測定不同花色單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙莖、葉、花中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1,4萘醌、山奈酚含量。采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,乙腈-25%乙酸水為流動相,梯度洗脫進行分離,檢測波長245 nm。指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1,4萘醌、山奈酚在選定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為 1013%、9893%、10117%、10159%,RSD分別為0986%、196%、237%、127%,該方法簡單、快速、準(zhǔn)確,可作為鳳仙花中萘醌類和黃酮類物質(zhì)同時測定的方法。

    關(guān)鍵詞:鳳仙花;萘醌;黃酮;高效液相色譜法

    中圖分類號: O6577+2文獻標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(201412-0344-03[HS][HT9SS]

    收稿日期:2014-07-18

    基金項目:國家科技支撐計劃(編號:2012BAD36B01 。

    作者簡介:姜洪芳(1974—,女,博士研究生,副研究員,從事天然產(chǎn)物活性物質(zhì)應(yīng)用與開發(fā)。E-mail:jhf74@163com。

    通信作者:張衛(wèi)明,研究員,從事植物活性物質(zhì)的應(yīng)用與開發(fā)。E-mail:botanyzh@163com。

    鳳仙花(Impatiens balsamina L為鳳仙花科(Balsaminaceae鳳仙花屬(Impatiens一年生草本植物。鳳仙花屬共有植物900余種,全球均有分布。鳳仙花作為觀賞植物在國內(nèi)外均有種植,也是該屬植物的常見品種,其花、莖、葉、種子在民間有悠久的藥用歷史,被廣泛用于治療腰脅痛、 蛇咬傷、 鵝掌風(fēng)、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 癰癤瘡疔、 胎衣不下、 潰瘍?nèi)站貌挥徒?jīng)閉腹痛等,2010年版《中國藥典》收載其種子急性子作為藥用部位。鳳仙花的化學(xué)成分主要有黃酮、萘醌、香豆素、有機酸、花青素和甾醇類,其中黃酮和萘醌有很強的抗炎、抗菌、抗過敏和抑制Wnt信號通道等活性;據(jù)報道指甲花醌和2-甲氧基-1,4萘醌是該植物抗細(xì)菌和抗真菌的活性成分,2-甲氧基-1,4萘醌具有很強的對抗HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性[1-3]。國內(nèi)外已有文獻報道,用高效液相色譜法(HPLC分別定量測定鳳仙花中的黃酮和萘醌類成分[4-7],但對于2類成分含量的同時測定還未見報道,本研究應(yīng)用HPLC對常見品種單瓣鳳仙花和多重瓣茶鳳仙在7月盛開期的莖、葉、花中指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山萘酚進行了測定,為該屬植物的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

    1材料與方法

    11材料

    高效液相色譜儀Agilent 1200 HPLC(美國安捷倫公司生產(chǎn),G1354A四元泵,G1313A自動脫氣機,G1316柱溫箱,G1315B二極管陣列檢測器。

    Q-600DE型超聲波清洗器,江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn);

    高效液相色譜(HPLC分析用甲醇、乙腈為色譜純(美國天地;試驗用水為超純水,提取用試劑均為分析純。

    對照品包括指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚,均購于中國食品藥品檢定研究院,純度大于98%。單瓣鳳仙花及多重瓣茶鳳仙的莖、葉、花均于2012年7月采自南京,經(jīng)南京野生植物研究院張玖教授鑒定為鳳仙花(Impatiens balsamina L。

    12HPLC分析條件

    Agilent Eclipse XDB-C18分離柱(46 mm×150 mm,5 μm;流動相為乙腈-25%醋酸水,梯度洗脫條件:0~10 min,25 ∶[G-3]75;10~20 min,32 ∶[G-3]68;20~35 min,25 ∶[G-3]75,流速10 mL/min,進樣量20 μL,柱溫為25 ℃,DAD檢測器,檢測波長245、250、280、360 nm。

    13對照品溶液的制備

    分別稱取指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚對照品10 mg,精確稱定,甲醇溶解并定容,稀釋成濃度為50、40、25、125、10、625、312 μg/mL的溶液,經(jīng)045 μm 微孔濾膜過濾,供HPLC測定,并繪制每種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    14供試品溶液的制備

    稱取樣品粉末 (50 ℃ 烘干12 h,磨碎過40目篩 50 g,精確稱定,加入55% 乙醇水溶液80 mL,室溫浸泡2 h,超聲提取 1 h,定容至100 mL,濾液經(jīng)045 μm 的微孔濾膜過濾,供HPLC測定。

    2結(jié)果與分析

    21標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC測定

    在“12”節(jié)色譜條件下,樣品中指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1,4萘醌、山奈酚色譜峰的保留時間與對照品一致,4種成分的色譜峰均能得到較好的分離,樣品其他成分對欲測成分的測定無干擾(圖1。

    22線性關(guān)系分析

    將不同梯度濃度的混合對照品溶液分別進樣,進樣量為20 μL,以峰面積y為縱坐標(biāo),進樣質(zhì)量濃度x (μg/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1。

    23精密度試驗

    準(zhǔn)確吸取25 μg/mL指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚混合對照品溶液20 μL,按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測,重復(fù)測定3次,記錄保留時間和峰面積,計算各個化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD,均小于 15%(表2,表明儀器精密度良好。

    24重復(fù)性試驗

    精確稱取紅色鳳仙花葉子粉末5002 3 g,共5份,按照“22”節(jié)方法制備供試品溶液,再按照“23”節(jié)建立的方法進行檢測,重復(fù)測定3次,記錄各化合物峰面積,計算得到各化合物含量的RSD為115 %~237%(表3,表明該方法的重現(xiàn)性良好。

    25穩(wěn)定性試驗

    供試品溶液于配制后4、10、14、24 h分別進樣,記錄峰面

    [F(W21][TPJHF1tif][F][FL]

    [F(W9][HT6H][J]表1鳳仙花中不同化合物的線性方程[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG3,W12,W16,W8,W16,W8W]化合物質(zhì)量濃度(μg/mL保留時間(min線性方程相關(guān)系數(shù)

    [BHDG12,W12Q3,W16DW,W8DW,W16Q4,W8W]指甲花醌325~520066y=9821x+83960997

    [BHDW]槲皮素700~5600105y=4030x-258100997

    2-甲氧基-1,4萘醌3625~58000121y=9436x-13340998

    山奈酚3625~58000164y=5737x+31050994[HJ][BG)F][F)]

    [FL(22]

    [F(W8][HT6H][J]表2鳳仙花中不同化合物的保留時間和峰面積精密度[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG3,W9,W20W]化合物[B(][BHDWG12,W10。2W]保留時間峰面積[XXSX2-SX92]均值(minRSD(%[XXSX2-SX92]均值RSD(%[BW]

    [BHDG12,W9Q0,W5。4DWW]指甲花醌680452 986087

    [BHDW]槲皮素1070621 238123

    2-甲氧基-1,4萘醌1230662 784116

    山奈酚1650831 610135[HJ][BGF]

    注:n=3。[F]

    積,結(jié)果峰面積RSD分別為指甲花醌135%、槲皮素236%、2-甲氧基-1、4萘醌253%、山奈酚236%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    26加標(biāo)回收率

    [CM(24]精確稱取已知含量的紅色鳳仙花的葉子3份,按照[CM]

    [F(W9][HT6H][J]表3紅色鳳仙花葉子中不同化合物的含量[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG3,W11,W9。2W]化合物含量均值(%RSD(%

    [BHDG12,W11Q1,W9。2DWW]指甲花醌0204 8115

    [BHDW]槲皮素0074 6187

    2-甲氧基-1,4萘醌0078 3237

    山奈酚0083 2216[HJ][BGF]

    注:n=5。[F]

    “22”節(jié)方法制備供試品溶液,分別加入50、25 、125 μg/mL指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1,4萘醌、山奈酚混合對照品溶液,按樣品測定項下方法進行操作,每個濃度每天測定3次,連續(xù)測定3 d,取其平均值,計算回收率(表4。

    [FL]

    [F(W8][HT6H][J]表4紅色鳳仙花葉子的回收率試驗結(jié)果[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG3,W12,W36,W12W]化合物[B(][BHDWG12,W36W]回收率(%[BHDWG12,W12。3W][XXSX2-SX352]第1天第2天第3天RSD(%

    [BHDG12,W12Q1,W12。4W]指甲花醌10021±13510213±12310156±11510130±099

    [BHDW]槲皮素9673±1289958±1 5210048±2329893±196

    2-甲氧基-1,4萘醌9857±10710173±16110321±09610117±237

    山奈酚10026±18510172±218 10279±15610159±127[HJ][BGF]

    注:n=3。[F]

    [FL(22]27樣品測定

    按照“22”節(jié)及“23”節(jié)的方法操作,測定不同鳳仙花樣品的指甲花醌、槲皮素、2-甲氧基-1,4萘醌、山奈酚峰面積,按照“表1”中的標(biāo)準(zhǔn)方程計算出各種化合物的含量,結(jié)果見表5。

    [FL]

    [F(W10][HT6H][J]表5鳳仙花中萘醌及黃酮化合物含量[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG42,W6,W54W]鳳仙花樣[B(][BHDWG12,W54W]化合物含量(%

    [BHDWG12,W132。4W][XXSX2-SX532]指甲花醌2-甲氧基-1,4萘醌槲皮素山奈酚

    [BHDWG12,W42。12W][XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花[XXSX2-SX13]莖葉花

    [BHDG12,W6,W42。12DWW]白色020106900258 006100810836004601750133005303680714

    [BHDW]紫色083202140321019400450258003101410131009601770653

    紅色011702070236018200800626005500730158007400760603

    粉紫色00710342030200040042063200870135002801020362

    多重花瓣048400900337008400060135006100670100012801890765[HJ][BG)F][F)]

    [FL(22]指甲花醌含量在鳳仙花的葉、花中較高,多數(shù)集中在02%~07% 之間,在紫色鳳仙花的莖中含量最高,為0832%,多重瓣茶鳳仙的莖中含量為0484%;2-甲氧基-1,4萘醌普遍分布在花中,以白色鳳仙花中為最高,達0836%;可見,萘醌類在植株中的總量以白色鳳仙花最高,為2127%,紫色鳳仙花位居第2 ,為1864%,多重瓣茶鳳仙最低,為1136%。槲皮素主要分布在葉和花中,以白色鳳仙花的葉子為最多,達0175%;山奈酚主要分布在各色鳳仙花的葉和花中,多重瓣茶鳳仙含量最高,達0765%,白色鳳仙花中為0714%;以槲皮素和山奈酚為代表的黃酮類物質(zhì)在植株中的總量以白色鳳仙花最高,達1489%,多重瓣茶鳳仙花和紫色鳳仙花分別為1310%、1229%,粉紫色鳳仙花最低,為0714%。

    3討論與結(jié)論

    31提取溶劑的優(yōu)化

    為了使供試品溶液獲得最佳的提取率,參照文獻 [4-7],應(yīng)用HPLC法比較水、55% 乙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯室溫下對紅色鳳仙花葉子浸泡提取的指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚的含量,以55% 乙醇溶液為溶劑能夠?qū)?種物質(zhì)最大量地提取出來。

    32HPLC檢測波長的選擇

    由于指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚的最大吸收波長不完全一致,如指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌最大吸收波長為250、280、350 nm,其中350 nm處的吸光度比較弱,槲皮素最大吸收波長為255、370 nm,山奈酚最大吸收波長為266、367 nm[5-7],在HPLC分析中,DAD檢測器設(shè)置了245、250、280、360 nm多通道檢測模式,結(jié)果表明,4個化合物在245 nm處的峰面積均高于其他波長處的峰面積,所以選擇245 nm作為液相色譜分析的檢測波長,從而提高了檢測方法的靈敏度。

    33HPLC流動相的確定

    通過HPLC分析條件的篩選,有利于在最短的時間內(nèi)將復(fù)雜組份完全分離,特別是有多個樣品需要分析時。用甲醇-水、乙腈-水對鳳仙花的葉子提取物進行分析,結(jié)果顯示乙腈-水分離效果優(yōu)于甲醇-水,縮短了分離時間,將25% 醋酸加入到水中,可以將欲分離的萘醌類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)達到基線分離,同時進行定量測定。

    [JP2]從總體來看,白色鳳仙花的萘醌類和黃酮類物質(zhì)含量較高,國外大量研究也是圍繞白色鳳仙花開展的,但紫色、粉紫色及多重瓣茶鳳仙中也含有較高的活性物質(zhì),可以作為藥用植物進行研究與應(yīng)用。 生長環(huán)境、采收時間、種植資源等因素都會影響植物次生代謝產(chǎn)物的含量,可以利用能增加次生代謝產(chǎn)物的有利因素,進行組織培養(yǎng),增加次生代謝產(chǎn)物的含量。

    本試驗建立了HPLC同時測定鳳仙花中指甲花醌、2-甲氧基-1,4萘醌、槲皮素、山奈酚含量的方法,該方法可同時測定萘醌、黃酮2類成分,可用于鳳仙花藥材的質(zhì)量控制。

    [HS2][HT85H]參考文獻:[HT8SS][HJ19mm]

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