C4二羧酸全生物合成技術(shù)的研究現(xiàn)狀與展望

孫小龍　付永前

摘要：富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸是3種典型的C4二羧酸，目前工業(yè)化生產(chǎn)富馬酸多采用化學(xué)合成法，以石油基富馬酸為平臺化合物，進(jìn)一步衍生出L-蘋果酸和L-天冬氨酸。依托于石油基工業(yè)生產(chǎn)C4二羧酸的工藝不僅帶來較多負(fù)面問題，同時也限制了3種C4二羧酸在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著生物制造技術(shù)的不斷發(fā)展，開發(fā)C4二羧酸全生物合成技術(shù)成為歷史必然。本文對生物合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸的現(xiàn)狀及存在問題進(jìn)行了綜述，并對3種C4二羧酸的全生物合成技術(shù)的可行性及發(fā)展進(jìn)行了分析與展望。

關(guān)鍵詞：富馬酸；L-蘋果酸；L-天冬氨酸；生物合成

中圖分類號： Q89文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-007-04

依托于石油基工業(yè)的C4二羧酸是重要的基礎(chǔ)化工原料，其應(yīng)用范圍已涉及到國民生活中的各個方面，儼然成為社會穩(wěn)定、人類可持續(xù)發(fā)展的重要基石。富馬酸是一種典型的C4二羧酸，可廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、涂料等行業(yè)，目前全世界富馬酸的需求量為00×06 t/年，我國富馬酸產(chǎn)能就達(dá)到了（0～5）×05 t/年，其中，有40%來自江蘇，主要生產(chǎn)企業(yè)包括常茂生化有限公司、宜興前成有限公司、南京利邦有限公司等，其中2/3市場份額主要用于生產(chǎn)不飽和樹脂、醇酸樹脂，而純度高于99%的食品級富馬酸（主要應(yīng)用于酸味劑、防腐劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、飼料添加劑等領(lǐng)域），加上醫(yī)藥級富馬酸鹽（主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)上）不足市場份額的/3。目前工業(yè)上富馬酸主要通過順酐異構(gòu)和糠醛氧化等化學(xué)方法制得，其制備工藝過程普遍存在生產(chǎn)條件苛刻、催化劑毒性大、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，嚴(yán)重破壞了人類的生存環(huán)境，同時產(chǎn)品的安全性限制了在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

L-蘋果酸是利用富馬酸衍生的C4二羧酸之一。國內(nèi)蘋果酸的生產(chǎn)企業(yè)主要包括南京國海有限公司、常茂生化有限公司、恒康有限公司等，生產(chǎn)工藝主要采用石油基富馬酸，通過生物酶轉(zhuǎn)化合成L-蘋果酸，石油基富馬酸所存在的安全性同樣也限制了L-蘋果酸的進(jìn)一步應(yīng)用，然而，L-蘋果酸所具有的多種特殊生理功能，如護(hù)肝、解毒、抗疲勞、減肥等，給其發(fā)展帶來了巨大的市場空間，同時，L-蘋果酸在某些新興應(yīng)用領(lǐng)域也具有巨大的市場，如南京國海開發(fā)的DME添加劑能抑制瘤胃酸中毒，提高飼料利用率，增加產(chǎn)奶量。此外，蘋果酸作為酸味劑，在某些傳統(tǒng)領(lǐng)域部分替代檸檬酸，將增加（20～30）×05 t的潛在市場[2]。

L-天冬氨酸是另外一種利用富馬酸衍生的C4二羧酸，其國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)主要包括江蘇杰成生化有限公司、常茂生化有限公司等。其售價受到原油及石化原料的波動而變化，200年的售價在2 000元/t左右，現(xiàn)在生產(chǎn)工藝中原料及環(huán)保處理成本高，占到生產(chǎn)成本的0%～5%，并且消耗大量的硫酸和液氨，導(dǎo)致生產(chǎn)規(guī)模不能擴(kuò)大。然而，天冬氨酸的聚合物聚天冬氨酸可廣泛應(yīng)用于作物生長促進(jìn)劑、水處理劑等領(lǐng)域，同時隨著L-天冬氨酸在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，市場容量會持續(xù)增加，預(yù)計(jì)今后幾年需求量會達(dá)到20×05 t/年[3]。

隨著石油資源的日益枯竭和不可再生資源價格的節(jié)節(jié)攀升，發(fā)展環(huán)境友好的生物基化學(xué)品的生物制造技術(shù)已成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長方式、保障生態(tài)鏈良好循環(huán)、實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。生物制造技術(shù)的發(fā)展，可以高效地制備替代石油化工原料的C-C4平臺化合物，進(jìn)而與現(xiàn)代新型綠色化工技術(shù)和產(chǎn)業(yè)相銜接，大規(guī)模生產(chǎn)各種生物基化學(xué)品，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，提升傳統(tǒng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)競爭力。2009年OECD“面向2030生物經(jīng)濟(jì)施政綱領(lǐng)”戰(zhàn)略報(bào)告預(yù)計(jì)，到2030年，將有35%的化學(xué)品和其他工業(yè)品來自生物制造，生物經(jīng)濟(jì)中生物制造產(chǎn)業(yè)的貢獻(xiàn)率將占39%，超過生物醫(yī)藥和生物農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。

利用生物法合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸等C4二羧酸，是化工行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇，受制于當(dāng)前成熟石油基催化工藝的相對低廉成本，生物基C4二羧酸的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化尚缺乏與化工產(chǎn)品全面競爭的優(yōu)勢，因此，提高產(chǎn)品附加值是實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。隨著健康理念深入人心，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，利用生物法合成富馬酸，繼而生產(chǎn)出L-蘋果酸、L-天冬氨酸等相關(guān)衍生產(chǎn)品更能符合人們消費(fèi)需求和消費(fèi)心理，市場前景廣闊。在此，本文對生物合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸的現(xiàn)狀及存在問題進(jìn)行綜述，并對3種C4二羧酸的全生物合成技術(shù)的可行性及發(fā)展進(jìn)行分析和展望。

[WTHZ]生物合成C4二羧酸的國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀

生物合成富馬酸

發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的研究開始于20世紀(jì)初，F(xiàn)oster教授從分別來自8個不同屬的4株菌株中篩選出根霉菌是生產(chǎn)富馬酸的最佳菌株，開啟了根霉菌發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究歷程[4]。不過由于當(dāng)時技術(shù)的局限性，生物合成富馬酸還處于較低的水平，基本上處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。隨著20世紀(jì)70年代爆發(fā)第次石油危機(jī)以來，世界各國科學(xué)家都開始研究生物法替代化學(xué)法合成富馬酸。于是，選育性能優(yōu)良的菌株，利用物美價廉且來源豐富的生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)富馬酸受到了越來越多的關(guān)注，意大利、德國、美國、日本等國的學(xué)者在這方面都做了大量的工作。988年，美國Duont公司申請了有關(guān)利用根霉屬真菌發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸的專利，發(fā)酵碳源、氮源、無機(jī)鹽及溶氧對富馬酸的生產(chǎn)具有重要影響，發(fā)酵70 h后，富馬酸的最高產(chǎn)量達(dá)到20 g/L，但發(fā)酵液中琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸等多種雜酸含量較高，占發(fā)酵產(chǎn)酸比例的22%[5]。996年旋轉(zhuǎn)生物膜反應(yīng)分離耦合裝置替代中和劑的使用，解除富馬酸的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，在20 h內(nèi)生產(chǎn)富馬酸的平均產(chǎn)量多達(dá)85 g/L，但膜反應(yīng)器經(jīng)濟(jì)成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)[6]。我國科學(xué)家對生物合成富馬酸的研究始于20世紀(jì)70年代中期，975年，山西微生物研究所的張俊賢篩選出株具有產(chǎn)富馬酸能力的Rarrhizus，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探索。當(dāng)振蕩培養(yǎng)于含有2%的葡萄糖培養(yǎng)基時，富馬酸產(chǎn)量為535 g/L，得率為446%，同時發(fā)酵液中還含有較多的副產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸[7]。

2006年以來，我們針對生物合成富馬酸工藝中存在問題進(jìn)行技術(shù)攻關(guān)，在菌種優(yōu)化方面，本團(tuán)隊(duì)以富馬酸菌株Roryzae為主要研究對象，通過紫外誘變或化學(xué)誘變等手段，以丙烯醇、溴甲酚綠為篩選標(biāo)記，獲得副產(chǎn)物乙醇含量低、富馬酸產(chǎn)量高的突變株，該菌株已申請了專利[8-9]，奠定了米根霉發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的工業(yè)化進(jìn)程基礎(chǔ)；在菌體培養(yǎng)方面，針對菌種培養(yǎng)難的問題，建立了一套逐級放大、面向工業(yè)化應(yīng)用的米根霉細(xì)胞培養(yǎng)策略[0]，解決了實(shí)際生產(chǎn)中可能存在的生物量需求問題，為自固定化米根霉產(chǎn)富馬酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；在發(fā)酵調(diào)控方面，建立了雙階段溶氧調(diào)控策略，即在發(fā)酵前8 h控制溶氧濃度在80%，8 h后調(diào)至30%，富馬酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率以及富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了 562 g/L，542 % 和07 g/（L·h）。在該調(diào)控策略基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)米根霉在攪拌式反應(yīng)器發(fā)酵與離子交換樹脂分離耦合生產(chǎn)富馬酸的新型工藝路線，使富馬酸產(chǎn)量為 586 g/L，糖酸得率為076 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度72 g/（L·h），樹脂可循環(huán)使用0批次，具有操作簡便、體系穩(wěn)定、操作時間長等優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前生物合成富馬酸的生產(chǎn)成本，與化工法相比還有一定差距。因此，開發(fā)廉價的生物基富馬酸合成路線，以及開發(fā)生物基富馬酸的高附加值衍生產(chǎn)品如L-蘋果酸、L-天冬氨酸等是未來發(fā)展方向。

2生物合成蘋果酸

20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)某些酵母和曲霉在代謝過程中積累蘋果酸，隨后世界各國陸續(xù)開展了生物合成蘋果酸的研究。然而，目前發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的研究還未有重大進(jìn)展，正在研究的發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的工藝主要有兩類：一是兩步發(fā)酵法，或稱轉(zhuǎn)化發(fā)酵法，先用一株菌株在糖質(zhì)發(fā)酵液中產(chǎn)生富馬酸，然后接入另一株菌株繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，將富馬酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸。一般是先用少根根霉（Rhizopus arrhizus）或華根霉（Rhizopus chinensis）把糖質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為富馬酸，然后再用膜醭畢赤酵母（ichia membranefaciens）或普通變形桿菌（roteus vulgaris）及宛氏擬青霉（aecilomyces varioti）轉(zhuǎn)化富馬酸。日本佐佐木等[3]從假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、酵母屬和球擬酵母屬的23株酵母菌中發(fā)現(xiàn)膜醭畢赤酵母的富馬酸轉(zhuǎn)化率最高。而有研究結(jié)果表明[4-5]，將華根霉6508接入一定培養(yǎng)基，在30 ℃振蕩培養(yǎng) 5 d，接入畢赤酵母再培養(yǎng)5 d，產(chǎn)生的蘋果酸對可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)625%。國內(nèi)的胡純鏗等[6]用少根根霉A-23接入含有50 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中3 d后，再接入普通變形桿菌V-8繼續(xù)培養(yǎng)2 d，L-蘋果酸濃度達(dá)733 g/L，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為656%。二是以曲霉為菌種的一步發(fā)酵法。直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸可追溯到928年，Yuill[7]報(bào)道在培養(yǎng)黃曲霉（Aspergillus flavus）時，有少量L-蘋果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產(chǎn)生。953年，Godin[8]報(bào)道了短密青霉有產(chǎn)蘋果酸的能力。日本學(xué)者從20世紀(jì)50年代末起，對蘋果酸發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行了大量研究，Abe等[9]研究的發(fā)酵法產(chǎn)蘋果酸最高濃度達(dá)50 g/L。99年，以色列研究者[20]在6 L攪拌罐中利用黃曲霉發(fā)酵產(chǎn) L-蘋果酸，通過條件優(yōu)化，在葡萄糖初始濃度20 g/L、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、Fe2濃度2 mg/L、氮源濃度27 mg/L、磷酸鹽濃度5 mol/L，以及中和劑CaCO3濃度90 g/L的條件下發(fā)酵培養(yǎng)92 h，產(chǎn)酸可達(dá) 3 g/L，對葡萄糖的實(shí)際摩爾轉(zhuǎn)化率為28%，但據(jù)報(bào)道該菌產(chǎn)生致癌性物質(zhì)黃曲霉毒素，并且伴有其他四碳酸產(chǎn)生。然而上述利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的微生物多為曲霉（Aspergillus sp），這些菌株大多具有糖化淀粉的能力，可以直接利用淀粉質(zhì)原料，發(fā)酵工藝條件溫和，與其他L-蘋果酸制備方法相比具有自身的優(yōu)勢，但其次生代謝產(chǎn)物中可能存在對人體及動物有致癌作用的黃曲霉毒素，倍受爭議。除利用曲霉菌外，也有人提出使用根霉菌利用糖質(zhì)和營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在滿足發(fā)酵的諸條件下直接生產(chǎn)出L-蘋果酸，然而該方法還處于研究的初步階段。目前我們篩選到株相對高產(chǎn)出L-蘋果酸的根霉菌，該菌株富馬酸產(chǎn)量較低[2-22]。

由于原料成本以及技術(shù)水平的限制，以上兩種工藝均未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著酶工程技術(shù)及固定化技術(shù)的發(fā)展，日本學(xué)者使用聚丙烯酰胺凝膠包埋產(chǎn)氨短桿菌細(xì)胞，首次實(shí)現(xiàn)了L-蘋果酸的連續(xù)化產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，00 L罐中日產(chǎn)酸達(dá) 54 kg。該工藝是目前L-蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法，然而，該工藝的催化底物為石油基富馬酸，安全性受到了限制，從而制約了其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著社會的進(jìn)步，全生物基L-蘋果酸越來越受到廣大消費(fèi)者的青睞。L-蘋果酸的全生物合成技術(shù)的研究與開發(fā)，將為L-蘋果酸在醫(yī)藥以及食品領(lǐng)域開拓非常廣闊的市場。

3生物合成L-天冬氨酸

自953年，L-天冬氨酸已開始采用發(fā)酵或生物催化合成進(jìn)行生產(chǎn)。如采用基因工程大腸桿菌以葡萄糖為碳源直接發(fā)酵生產(chǎn)L-天冬氨酸，或利用天冬氨酸酶催化富馬酸轉(zhuǎn)氨生產(chǎn)L-天冬氨酸。日本科學(xué)家在這方面開展了大量工作。內(nèi)尾等報(bào)道用黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）的谷氨酸缺陷型突變株，在含36%葡萄糖的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)4 d，生產(chǎn)天冬氨酸 4 g/L[23]。椎尾等用黃色短桿菌[2]的檸檬酸合成酶缺失株[23]，在含36%葡萄糖的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，生產(chǎn)天冬氨酸06 g/L。后來他們進(jìn)一步還用黃色短桿菌的丙酮酸激酶缺失株，在限制生物素條件下，培養(yǎng)2 d，由00 g/L葡萄糖生產(chǎn)天冬氨酸226 g/L。后藤等用5%葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)佛拉氏鏈霉菌生成天冬氨酸0 g/L。木下等用營養(yǎng)培養(yǎng)基或其中加05%富馬酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)巨大芽孢桿菌 d后，添加富馬酸的氨水中和液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d生成天冬氨酸06 g/L。

與發(fā)酵法相比，酶催化具有生產(chǎn)工藝簡單、副產(chǎn)物少、易于分離精制等優(yōu)點(diǎn)，菌種的篩選也較發(fā)酵法簡單易行。木住等最先使用酶催化轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天冬氨酸，即在富馬酸鈉和氯化銨的混合溶液中，添加啤酒酵母，利用啤酒酵母的天冬氨酸酶催化制得天冬氨酸[24]。后來，北原等用天冬氨酸酶活性高的大腸桿菌突變株的凍干菌體，由富馬酸制得了天冬氨酸。接著又發(fā)現(xiàn)十六烷基吡啶氯化物之類的表面活性劑、高級脂肪酸等能夠增加天冬氨酸收率。另外，他們還找到一種三葉假單孢菌，該菌不加表面活性劑，也能進(jìn)行酶反應(yīng)，培養(yǎng)該菌株，每升培養(yǎng)液可生產(chǎn)400 g天冬氨酸。一些研究結(jié)果還表明，可以用好熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌及短桿菌的α-氨基正丁酸抗性突變株的天冬氨酸酶，將富馬酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸[25]。但由于分離和固定化天冬氨酸酶的穩(wěn)定性不好，973年日本田邊制藥株式會社把細(xì)胞固定在聚丙烯酰胺上，得到固定化全細(xì)胞作為催化劑，該工藝是第一個成功的固定化全細(xì)胞應(yīng)用實(shí)例，開創(chuàng)了應(yīng)用生物催化法生產(chǎn)氨基酸的先河。

日本學(xué)者高尾等人曾經(jīng)開展過雙菌發(fā)酵生成天冬氨酸的研究，該方法先用葡萄糖培養(yǎng)根霉菌進(jìn)行富馬酸發(fā)酵，然后接入天冬氨酸酶活性高的普通變形桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，把富馬酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，最后生成天冬氨酸499 g/L，對初始糖收率為624%。該研究具有重要意義，在雙菌偶聯(lián)發(fā)酵上進(jìn)行了一個有效的探索，但是天冬氨酸的最終濃度及對初始糖的轉(zhuǎn)化率不是太高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

[WTHZ]2全生物合成C4二羧酸技術(shù)的發(fā)展趨勢

生產(chǎn)成本高，缺乏與同類石油基產(chǎn)品的價格競爭優(yōu)勢是困擾絕大多數(shù)生物基大宗化學(xué)品產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的世界難題。然而，隨著健康理念深入人心，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，利用生物法合成富馬酸，針對生產(chǎn)成本高，無價格優(yōu)勢等特點(diǎn)，以降低大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)成本為核心，重點(diǎn)開發(fā)低廉高效的富馬酸生產(chǎn)工藝，繼而生產(chǎn)L-蘋果酸、L-天冬氨酸等衍生產(chǎn)品的全生物合成路線更能符合人們消費(fèi)需求和消費(fèi)心理。

2生物合成富馬酸的廉價工藝開發(fā)

生產(chǎn)成本高是阻礙生物基富馬酸產(chǎn)業(yè)化的重要因素，降低原料成本以及提高菌種的產(chǎn)酸能力成為解決這一問題的關(guān)鍵點(diǎn)。以往的研究往往單純依賴于發(fā)酵工藝的調(diào)控，以提高糖酸轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)原料的利用率，所采用的原料基本為價格相對較貴的葡萄糖，發(fā)酵法制備富馬酸的成本居高不下，開發(fā)廉價的生物合成富馬酸路線將是降低生產(chǎn)成本的有效方法之一，其主要體現(xiàn)在：（）基于廉價原料的富馬酸低成本制備技術(shù)， 采用離子注入、飛秒激光誘變或常壓室溫等離子體誘變等技術(shù)，選育高糖化酶活力富馬酸生產(chǎn)菌株的育種思路，以期實(shí)現(xiàn)以廉價淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的工藝過程，拓寬米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的底物譜，從源頭降低發(fā)酵成本；結(jié)合米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸的特性，篩選合適的淀粉質(zhì)原料，優(yōu)化同步糖化工藝，實(shí)現(xiàn)米根霉利用廉價淀粉質(zhì)原料高效積累富馬酸的工藝路線，基于過程控制等關(guān)鍵技術(shù)，完成同步糖化工藝的生產(chǎn)方法，全面降低發(fā)酵法制備富馬酸的成本；（2）基于殼聚糖/殼聚糖-富馬酸聯(lián)產(chǎn)的木質(zhì)纖維素全煉制技術(shù) 采用蒸爆、酸解等技術(shù)對非糧生物質(zhì)資源進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)現(xiàn)葡萄糖、木糖的有效分離。解析原料預(yù)處理液（主成分為木糖）中各種成分對米根霉生物量積累及殼聚糖/殼寡糖合成的作用機(jī)理，提高殼聚糖/殼寡糖的積累量，同時進(jìn)一步優(yōu)化米根霉利用酶解液（主成分為葡萄糖）發(fā)酵產(chǎn)酸，在完成分步利用非糧生物質(zhì)中木糖、葡萄糖聯(lián)產(chǎn)殼聚糖/殼寡糖與富馬酸的工藝基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)非糧生物質(zhì)全利用。目前，我們突破傳統(tǒng)富馬酸的生產(chǎn)思路，創(chuàng)新性地提出了雙階段利用玉米秸稈中木糖、葡萄糖的工藝路線，木糖用于米根霉生物量的培養(yǎng)，從而收獲殼聚糖/殼寡糖，葡萄糖用于米根霉的發(fā)酵產(chǎn)酸過程，實(shí)現(xiàn)富馬酸的積累。該方法突破了傳統(tǒng)方法對木質(zhì)纖維素的利用局限，充分發(fā)揮菌株特性，建立秸稈類原料聯(lián)產(chǎn)殼聚糖/殼寡糖和富馬酸的工藝路線，開拓木質(zhì)纖維素的利用范圍，為木質(zhì)纖維素的高效利用提供新的方向[26-27]。

22全生物合成L-蘋果酸以及L-天冬氨酸

傳統(tǒng)工藝中，富馬酸的生產(chǎn)與L-蘋果酸/L-天冬氨酸的生成是兩個獨(dú)立的過程，發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸多采用鈣鹽法作為中和劑，后經(jīng)濃縮、結(jié)晶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸/L-天冬氨酸，環(huán)境污染嚴(yán)重、能耗大。采用發(fā)酵-酶法耦合轉(zhuǎn)化生產(chǎn)工藝，串聯(lián)富馬酸的發(fā)酵過程及酶轉(zhuǎn)化過程，將是解決全生物合成L-蘋果酸/L-天冬氨酸問題的關(guān)鍵，我們已嘗試?yán)擞酶获R酸發(fā)酵液來生產(chǎn)L-天冬氨酸，并取得了初步效果[3]。因此在后期的研究，主要研究方向：（）發(fā)酵-酶法轉(zhuǎn)化耦合生產(chǎn)L-蘋果酸/L-天冬氨酸，采用雙步走的技術(shù)策略，以銨鹽/鈉鹽替換傳統(tǒng)工藝中的鈣鹽，或以反應(yīng)分離耦合的方式獲得富馬酸鈉/富馬酸銨，直接進(jìn)入下游的酶法轉(zhuǎn)化過程，生產(chǎn)L-蘋果酸/L-天冬氨酸；（2）高效細(xì)胞催化技術(shù)，解決現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中固定化酶使用壽命短、底物富馬酸分離難度大等問題，研究不同固定化方式、不同固定化顆粒大小對底物、產(chǎn)物擴(kuò)散速率的影響，固定化對細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化能力的影響，在不影響傳質(zhì)的同時防止酶的泄露，延長固定化細(xì)胞的使用壽命。

3展望

社會發(fā)展至今，人類開始追尋“源于自然、回歸自然”的生活理念，要求“吃的健康、用的安心”，在這樣一種消費(fèi)理念下，應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域的各類石油基產(chǎn)品受到了嚴(yán)重質(zhì)疑，而以生物質(zhì)原料為基礎(chǔ)的現(xiàn)代工業(yè)生物產(chǎn)品具有原料來源自然化，生產(chǎn)過程溫和化的典型特征，能夠滿足人類對健康、自然的追求，符合消費(fèi)者的消費(fèi)需求和心理，具有較強(qiáng)的市場接受度。故借助微生物的自然潛能，將天然生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成富馬酸、L-蘋果酸、L-天冬氨酸在食品、飼料、醫(yī)藥等各大行業(yè)中將具有強(qiáng)勁的競爭優(yōu)勢。因此，建立以生物質(zhì)為原料聯(lián)產(chǎn)富馬酸及下游高附加值衍生產(chǎn)品（L-蘋果酸、L-天冬氨酸）的工業(yè)微生物技術(shù)研究與應(yīng)用，提升C4二羧酸高端化學(xué)品的生物制造技術(shù)水平，也將是未來C4二羧酸的研究方向和發(fā)展趨勢。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS][H3mm]

[ZK（#]付永前 米根霉發(fā)酵與離子交換樹脂分離耦合生產(chǎn)富馬酸的研究[D] 南京：南京工業(yè)大學(xué)，2009

[2]何皓 米根霉直接發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的代謝調(diào)控研究[D] 南京：南京工業(yè)大學(xué)，2009

[3]盛曉燕 利用富馬酸發(fā)酵液制備L-天冬氨酸的工藝探索[D] 南京：南京工業(yè)大學(xué)，200

[4]Foster W，Waksman S A The production of fumaric acid by molds belonging to the genus Rhizopus ournal of the American Chemical Society，938，6：27-35

[5]Lorraine B，Ling N D，Thomas K N，et al Fermentation process for carboxylic acids：US，487773 988-08-09

[6]Cao N，Du ，Gong CS，et al Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column Applied and Environmental Microbiology，996，62（8）：2926-293

[7]張俊賢，蔣明珠，白照熙，等 無根根霉R25產(chǎn)延胡索酸的發(fā)酵條件 食品與發(fā)酵工業(yè)，988（5）：4-2

[8]Fu Y Q，Xu Q，Li S，et al Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway Korean ournal of Chemical Engineering，200，27（）：83-86

[9]黃和，高振，李霜，等 一種富馬酸產(chǎn)生菌及其誘變篩選方法和應(yīng)用：中國，CN000645 2008-0-09[ZK）]

[0][ZK（#]Fu YQ，Xu Q，Li S，et al A novel multi-stage preculture of Rhizopus oryzae ME-F2 strategy in the STR for fumaric acid production World ournal of Microbiology & Biotechnology，2009，25：87-876

Fu Y Q，Li S，Chen Y，et al Enhancement of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using a two-stage dissolved oxygen control strategy Applied Biochemistry and Biotechnology，200，62（4）：03-038

[2]黃和，付永前，李霜，等 一種分離提取富馬酸的方法：中國，CN0235394 2008-08-06

[3]王博彥，金其榮 發(fā)酵有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊[M] 北京：中國輕工業(yè)出版社，2000：540-567

[4]Takao S，Hotta K Conversion of fumaric acid fermentation to L-malic acid fermentation by the association of Rhizopus arrhizus and roteus vulgaris Ferment Bioeng，976，54：79-204

[5]Takao S，Yokota A，Tanida M L-malic acid fermentation by a mixed culture of Rhizopus arrhizus and aecilomyces varioti Ferment Bioeng，983，6：643-645

[6]胡純鏗，王國川 混合培養(yǎng)發(fā)酵L-蘋果酸的研究 華僑大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，2（）：76-79

[7]Yuill L Alcoholic fermentation by Aspergillus flavus，Brefeld Biochemical ournal，928，22（6）：504-507

[8]Godin Study of ternary metabolism in enicillium brevicompactumⅢ roduction of a polysaccharide by this mold Biochimica et Biophysica acta，953，2（4）：528-532

[9]Abe S，F(xiàn)uruya A，Saito T，et al Method of producing L-malic acid by fermentation：US，306390 962-0-02

[20]Battat E，eleg Y，Bercovitz A，et al Optimization of L-malic acid production by Aspergillus flavus in a stirred fermentor Biotechnology and Bioengineering，99，37（）：08-6

[2][3]何皓，李霜，徐晴，等 放線菌酮對米根霉積累L-蘋果酸代謝途徑的調(diào)控作用 過程工程學(xué)報(bào)，2009，9（）：53-56

[22]何皓，李霜，徐晴，等 積累L-蘋果酸的米根霉突變株酶活性初探 微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（3）：36-39

[23]Lee K M，Ramalingam K，ong-Keun S，et al A highly efficient and large-scale synthesis of（2S，3S）-[2，3-2H2]-and（2S，3R）-[3-2H] aspartic acids via an immobilized aspartase-containing microbiol cell system ournal of Organic Chemistry，989，54（3）：395-398

[24]Tsao G T，Cao N ，Du ，et al roduction of multifunctional organic acids from renewable resources Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，999，65：243-280

[25]Fujji G， Nishibayashi H reparation of DL-aspartic acid：，0724725 994-05-07

[26]Xu Q，Li S，F(xiàn)u Y Q，et al Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production Bioresource Technology，200，0（5）：6262-6264

[27]南京工業(yè)大學(xué) 一種利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法：中國，CN0575627 2009