太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

吉挺 沈芳 孟祥金 王帥 李文明

摘要：利用篩選后的2對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物，研究太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中華蜜蜂（以下簡稱中蜂）間的遺傳多樣性并分析其遺傳分化。研究檢測判定了60個(gè)中蜂個(gè)體的基因型，計(jì)算2個(gè)群體的優(yōu)勢等位基因頻率（i）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（IC）、群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis），并分析中蜂群體內(nèi)與群體間的遺傳變異，采取配對試驗(yàn)均數(shù)差異t檢驗(yàn)比較太湖中蜂與皖南中蜂群體的遺傳差異。結(jié)果表明，太湖地區(qū)與皖南山區(qū)2個(gè)中蜂群體間的i、He、IC、Fis差異均不顯著（i=0356>005，He=039>005，IC=0260>005，F(xiàn)is=0428>005）?？梢姡貐^(qū)與皖南地區(qū)兩地中蜂群體存在一定的遺傳多樣性，但遺傳分化程度不大。本研究結(jié)果對江蘇與安徽兩地中華蜜蜂品種的選育和保護(hù)也具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：太湖地區(qū)；皖南地區(qū)；中華蜜蜂；微衛(wèi)星DNA標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號： S898文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：002-302（204）2-002-05

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）簡稱中蜂，指分布于我國境內(nèi)東方蜜蜂地理亞種的總稱，是我國特有的遺傳資源，家養(yǎng)歷史悠久，2006年被列入國家畜禽保護(hù)名錄中。江蘇省自古是我國野生中蜂的聚居區(qū)，也是最早引入新法飼養(yǎng)的地區(qū)之一[2]。近幾十年來，由于西方蜜蜂大量引入及自然條件的破壞，江蘇省中蜂遺傳資源已消失迨盡，目前僅在環(huán)太湖地區(qū)略有分布，種質(zhì)資源保護(hù)迫在眉睫[3]。同時(shí)，隨著近幾年環(huán)太湖地區(qū)設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越來越多，現(xiàn)有的中蜂資源已不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。皖南地區(qū)地形復(fù)雜，植被豐富，適宜中蜂棲息，中蜂資源十分豐富[4]，而且皖南地區(qū)與太湖地區(qū)相隔較近，沒有任何地理隔離，所以從皖南地區(qū)引入蜂群可能是解決太湖地區(qū)中蜂資源缺乏的有效方法。但是引入后是否會改變太湖地區(qū)原有中蜂的遺傳結(jié)構(gòu)，繼而對當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源保護(hù)造成負(fù)面影響是應(yīng)該考慮的首要問題，所以需要對2個(gè)地區(qū)現(xiàn)有中蜂資源的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進(jìn)行比較分析。

微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳標(biāo)記，具有多態(tài)性好、共顯性、易于鑒定、檢測重復(fù)性好、在基因組分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）在其持續(xù)發(fā)展和管理動(dòng)物遺傳資源的戰(zhàn)略計(jì)劃中，推薦將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先考慮的分析工具[5-6]。近幾年來，微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于我國各地蜜蜂種質(zhì)資源的分析中，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力效率低，而且誤差較大[7-9]。本研究利用篩選后的2對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物對太湖地區(qū)與皖南地區(qū)的中蜂進(jìn)行遺傳多樣性比較和遺傳分化分析，旨在初步評價(jià)2個(gè)地區(qū)中蜂群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異，繼而探討江蘇省太湖地區(qū)異地引入蜂群的可能性。

材料與方法

試驗(yàn)材料

太湖地區(qū)中蜂（DS）來自于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)，皖南山區(qū)中蜂（X）來自于安徽省宣城市涇縣山區(qū)，每個(gè)地區(qū)各隨機(jī)選取30群，蜂群盡量以野生種群為主，每群隨機(jī)采集成年工蜂0只，用無水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群體的采集信息見表。

參照吉挺所建立的方法[0]提取中蜂基因組DNA，用微量紫外可見光度計(jì)（NanoDrop ND-000）測定其含量與純度，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2微衛(wèi)星引物的篩選及CR條件的優(yōu)化

根據(jù)筆者所在課題組對中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果所獲得的3 000多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選，每條染色體選擇2～3對微衛(wèi)星引物，共初步選取54對微衛(wèi)星引物，送往上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)GenBank和相應(yīng)文獻(xiàn)提供的微衛(wèi)星引物對所選54對引物進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步篩選出 30對擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物，具體所選微衛(wèi)星引物信息見表2。

由于CR反應(yīng)中影響因素較多，試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了以DNA模板濃度、Mg2濃度、Taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗(yàn)，最終確定CR的反應(yīng)體系：0×Buffer 20 μL，25 mmol/L MgCl2 0 μL，0 mmol/L dNTs 05 μL，0 pmol/μL 上游引物 0 μL，0 pmol/μL 下游引物 0 μL，5 U/μL Taq DNA聚

配制3%瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣6 μL，20 V電泳20 min，檢查產(chǎn)物的有無。如有產(chǎn)物，配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 mL體系，00 V預(yù)電泳5 min，點(diǎn)樣0 μL，20 V電泳3 h。進(jìn)行硝酸銀染色，直至出現(xiàn)清晰的等位基因條帶。

4熒光引物的篩選和組合

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，盡量選擇不同染色體上的標(biāo)記，淘汰掉無法擴(kuò)增以及無多態(tài)性的引物，最終選出相對較理想的2對多態(tài)性較豐富的微衛(wèi)星引物：7-CL278Contig（）、5-CL4Contig（γ）、39-CL308Contig6（X）、7-CL462Contig5（S）、8-CL470Contig3（T）、37-CL293Contig（W）、29-CL229Contig33（K）、28-CL650Contig3（B）、33-CL360Contig4（L）、-CL229Contig27（M）、4-CL549Contig3（R）、-CL33Contig4（Q）。每對引物的上游 5′ 端分別用熒光染料FAM（藍(lán)色）、HEX（綠色）、TAMRA（黃色）進(jìn)行標(biāo)記，獲得的熒光標(biāo)記引物避光保存。按照微衛(wèi)星引物的堿基長度進(jìn)行組合，為了便于區(qū)分得精確一些，組合的引物長度至少相差 20 bp，獲得的5個(gè)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物組合信息見表3。

CR熒光產(chǎn)物STR分型送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行，使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測序儀檢測。上樣的總體積為35 μL，其中的上樣液Hi-Di Formamide 0 μL、GS-500 Size Standard 05 μL，另外的3 μL為混合CR產(chǎn)物。將Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard 混合均勻后與等量的同一個(gè)體的CR產(chǎn)物進(jìn)行混合，然后進(jìn)行個(gè)體編號，依次加樣到96孔板中，接著變性和檢測。檢測結(jié)束后，使用GeneMapper 40軟件自動(dòng)生成獨(dú)立的圖譜文件，讀取片段長度、峰值和峰面積，判斷純合子和雜合子（單峰為純合子，雙峰為雜合子），最后導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表格。

6遺傳多樣性分析公式

6等位基因頻率

[Z]i=（2niinijnij2…nijn）/（2N）。

其中：i為第i個(gè)等位基因頻率；nii為第i個(gè)等位基因純合個(gè)數(shù)；jn為與i共顯的第n個(gè)等位基因；nij為含i與jn共顯的等位基因個(gè)體數(shù)；N為群體中個(gè)體數(shù)。

62雜合度

[Z]He=-∑[DD（]ki=-[DD）]2i。

其中：k為等位基因數(shù)；i為第i個(gè)等位基因頻率。

63多態(tài)信息含量

[Z]IC=-∑[DD（]ki=[DD）]2i-∑[DD（]k-i=[DD）]∑[DD（]kj=i[DD）]22i2j=2∑[DD（]k-i=[DD）]∑[DD（]kj=i[DD）]ij（-ij）。

其中：k為等位基因數(shù)；i為第i個(gè)等位基因頻率；j為第j個(gè)等位基因頻率。

64群體內(nèi)近交系數(shù)

[Z]Fis=（Hs-Ho）/Hs。

其中：Ho為觀察雜合度；Hs為平均期望雜合度。

65統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsatellite-Toolkit軟件根據(jù)GeneMapper 40軟件導(dǎo)出的Excel表格來計(jì)算等位基因頻率與期望雜合度，根據(jù)Botestein等的公式設(shè)計(jì)、計(jì)算群體的多態(tài)信息含量，再根據(jù)FSTAT程序計(jì)算群體內(nèi)近交系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2DNA提取結(jié)果

DNA提取出來以后，將其稀釋到00 ng/μL，部分瓊脂糖凝膠用紫外透視成像系統(tǒng)檢測，其結(jié)果如圖所示：純度比較高，無拖尾現(xiàn)象。

[FK（W0][TTtif][FK）]

22熒光產(chǎn)物STR分型結(jié)果

使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測序儀進(jìn)行檢測掃板，得到的部分微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增結(jié)果與STR分型結(jié)果見圖2。圖2所示的是太湖地區(qū)中蜂DS0個(gè)體在B位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果，基因型為32/34（雜合子）；皖南山區(qū)中蜂X03個(gè)體在T位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果，基因型為32/32（純合子）。

23太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂優(yōu)勢等位基因的比較

由表4可見，利用配對試驗(yàn)均數(shù)差異雙尾t檢驗(yàn)對2個(gè)群體優(yōu)勢等位基因頻率進(jìn)行處理，結(jié)果i=0356>005，即太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中蜂群體在這2對微衛(wèi)星引物標(biāo)記上檢測出來的優(yōu)勢等位基因差異不顯著。

24群體間相關(guān)參數(shù)分析

由表5可知，太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC、Fis平均為055、059、0053，均略高于皖南山區(qū)中蜂群體（0473、0423、025）。對2個(gè)群體的He、IC、Fis進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，2個(gè)群體的3個(gè)參數(shù)差異均不顯著（[HT5”]He=039、IC=0260、Fis=0428）。

3結(jié)論與討論

從2006年開始，陸續(xù)有研究者利用西方蜜蜂微衛(wèi)星標(biāo)記

對我國中蜂遺傳資源及遺傳多樣性進(jìn)行分析，但普遍方法是在CR擴(kuò)增后采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，通過人為觀察主觀地對多態(tài)性條帶進(jìn)行分析，這種方法最令人質(zhì)疑的在于很難將相鄰近的2個(gè)條帶準(zhǔn)確區(qū)分開來，從而造成判型誤差[7-8]。目前利用熒光引物擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的分辨率和靈敏度，對擴(kuò)增產(chǎn)物在單堿基水平和表達(dá)量方面也具有較高的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)利用ABI基因測序分析儀對熒光標(biāo)記DNA片段進(jìn)行檢測，并利用分子量內(nèi)標(biāo)對DNA片段長度進(jìn)行計(jì)算，使2個(gè)地區(qū)的中蜂STR分型方法較傳統(tǒng)方法更精確，更能真實(shí)反映2個(gè)群體內(nèi)的遺傳多樣性及群體間的遺傳分化。

本研究在筆者所在課題組對中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果所獲得的 3 000 多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基礎(chǔ)上篩選出2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，盡量保證其在多條染色體或連鎖群中都有分布，因此得出的數(shù)據(jù)有一定的代表性和可比性。群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因是進(jìn)化[CM（25]過程中由該等位基因突變形成的，因此微衛(wèi)星的多態(tài)性能

2K2]夠反映物種的進(jìn)化歷史[2]。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體的優(yōu)勢等位基因頻率間存在差異，但差異不顯著（i=0356>005），表明太湖地區(qū)中蜂群體（DS）與皖南地區(qū)（X）各自維持著一定的種質(zhì)特性，但兩者之間遺傳分化較小。這可能與這2個(gè)地區(qū)相隔距離較近、兩者基因流動(dòng)值較高有關(guān)，表明從皖南山區(qū)引入部分中蜂蜂群，擴(kuò)大太湖地區(qū)中蜂種群數(shù)量，進(jìn)行蜂蜜生產(chǎn)與授粉，不會對當(dāng)?shù)刂蟹溥z傳資源產(chǎn)生較大影響。

多態(tài)信息含量是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo)，當(dāng)IC>05時(shí)，該座位為高度多態(tài)性座位；當(dāng)025

期望雜合度別稱基因多樣度，是一個(gè)度量群體遺傳變異的最適參數(shù)[4]。本研究所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記中，、γ、T、R、Q、X、W等7個(gè)標(biāo)記有較高的多態(tài)性，群體遺傳多樣性豐富，具有較高的選擇潛力；而B標(biāo)記在2個(gè)群體間表現(xiàn)出完全不同的多態(tài)性，其在皖南山區(qū)中蜂群體中為純合子，而在太湖地區(qū)群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)（He=0875），今后可將其作為候選遺傳標(biāo)記區(qū)別2個(gè)地理群體。

本研究通過對太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測，對2個(gè)群體主要遺傳參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，2個(gè)群體間的He、IC、Fis差異均不顯著，其中太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC還略高于皖南山區(qū)，表明太湖地區(qū)中蜂遺傳多樣性仍較豐富，這可能與太湖地區(qū)蜜源植物資源豐富，適宜中蜂生存，同時(shí)該地區(qū)與種群數(shù)量較多的浙北和皖南山區(qū)沒有明顯的地理隔離，造成相互基因流動(dòng)有一定的關(guān)系。這也說明在分析中蜂群體遺傳多樣性時(shí)，種群數(shù)量與其擁有的遺傳多樣性高低沒有直接聯(lián)系。