金銀花SSR指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析

徐石勇　李歐靜　張舒瑋　鄧慧　劉征輝　王永　蘭青闊

摘 要：以金銀花及其常見變種為材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子指紋圖譜，并用于遺傳多樣性分析。選擇25個(gè)SSR位點(diǎn)用于多態(tài)性分析，其中3個(gè)位點(diǎn)具有較強(qiáng)多態(tài)性，并構(gòu)建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，包括3對(duì)引物在6個(gè)供試材料中擴(kuò)增到的18條多態(tài)性條帶信息。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)金銀花及其變種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)87個(gè)市售金銀花進(jìn)行分析，能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：金銀花；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.003

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，為常用大宗中藥材?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明金銀花中含有木犀草黃素、肌醇、皂甙、綠原酸，糖類、蛋白質(zhì)、維生素、多種化合物及多種微量元素，一些常用藥如銀翹解毒丸、清開靈、銀黃片等均以金銀花為主要原料。隨著我國對(duì)金銀花開發(fā)利用的突破性進(jìn)展，其在茶飲、日化、化妝品和保健品等領(lǐng)域的需求急劇增大。為滿足市場(chǎng)需求，我國近年來大面積種植金銀花藥材，但在種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析方面還沒有一套標(biāo)準(zhǔn)化的方法。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（一般為1～5個(gè)）核苷酸為重復(fù)單位組成的核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性、分布廣等優(yōu)點(diǎn)，常用于蔬菜遺傳育種[1]、基因定位[2]、遺傳圖譜構(gòu)建[3]、種質(zhì)鑒定等。玉米[4]、小麥[5]、棉花[6]等主要農(nóng)作物已建立成熟的基于SSR標(biāo)記的種子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及配套的指紋圖譜。本研究以金銀花及其常見變種為材料，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立指紋圖譜，并對(duì)河北、山東、河南金銀花樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，為促進(jìn)金銀花藥材鑒定標(biāo)準(zhǔn)化與品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、金銀花、金銀花4倍體等標(biāo)準(zhǔn)品（依次編號(hào)為S1～S6，表1），以及購自山東、河南的87個(gè)市售金銀花樣品，由天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，研磨后用于DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

參照Murray&Thompson[7]方法，做適當(dāng)改良后用于金銀花基因組DNA提取。DNA濃度用NanoDrop-1000 spectrophotometer（Thermo）檢測(cè)并稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR位點(diǎn)信息與引物

從GenBank數(shù)據(jù)庫查詢金銀花核酸序列369條，使用BatchPrimer3在線軟件掃描分[8]獲得32個(gè)候選SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)SSR-PCR引物。并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，確定25對(duì)引物（表2）用于多態(tài)性分析。

1.4 SSR-PCR分析

PCR反應(yīng)采用10 μL體系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·μL-1），滅菌去離子水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)反應(yīng)（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR儀為ABI veriti 96 well Thermol cycler。聚丙烯酰胺凝電泳：膠濃度為8%，電壓250 V，電泳1 h；采用銀染法進(jìn)行顯色。

1.5 數(shù)據(jù)分析

凝膠顯色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用GeneTools（Sygene）軟件對(duì)電泳圖譜中穩(wěn)定且易分辨的條帶進(jìn)行分子量分析；聚類分析使用SLT-NTSYS（2.10）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花SSR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

以6份材料DNA為模板，對(duì)25對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25對(duì)引物中4對(duì)無擴(kuò)增條帶，有13對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶大于1條，說明該13個(gè)SSR位點(diǎn)在6個(gè)材料中具有多態(tài)性。其中位點(diǎn)jp.ssr48、jp.ssr58和jp.ssr59多態(tài)性較高（圖1），適合于金銀花SSR分子指紋圖譜的構(gòu)建。

2.2 金銀花SSR指紋圖譜構(gòu)建

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，比較3個(gè)SSR位點(diǎn)在6份材料中的多態(tài)性。將每個(gè)樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進(jìn)行“1，0”標(biāo)注，構(gòu)建基于Excel格式的SSR指紋圖譜[9]。SSR指紋圖譜包含了6個(gè)材料3個(gè)SSR位點(diǎn)信息，共18個(gè)條帶，平均每對(duì)引物 6條（表3）。

2.3 金銀花SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析與應(yīng)用

對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明6個(gè)材料分為2大類（圖2），大毛花及其4倍體為一類，灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬為另一類，山銀花與金銀花遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28。山銀花中灰氈毛忍冬、華南忍冬遺傳距離最近，其次為紅腺忍冬，再次為黃褐毛忍冬。

使用上述3對(duì)SSR引物，對(duì)購自河北省巨鹿縣、山東省平邑縣、河南省封丘縣的87個(gè)金銀花樣品進(jìn)行PCR-SSR檢測(cè)及聚類分析。結(jié)果表明，三產(chǎn)地的樣品與山銀花的遺傳距離較遠(yuǎn)，全部為金銀花樣品；但又可分為兩類，其中一類為來自河北省巨鹿縣的50個(gè)樣品和來自河南省封丘縣的6個(gè)樣品，其一致性很強(qiáng)，表明兩地金銀花品種的親緣關(guān)系很近；來自山東省平邑縣的8個(gè)樣品被歸于另一類，但又細(xì)分為5小類。

3 結(jié)論與討論

來源純正、品質(zhì)優(yōu)良的藥用植物資源是中藥現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要前提。金銀花是我國常用大宗中藥材，亟需對(duì)其開展遺傳多樣性分析并建立標(biāo)準(zhǔn)化的種質(zhì)資源鑒定方法。自2007年以來，我國科學(xué)家應(yīng)用RAPD[10]、RFLP[11-12]、同工酶[13]、ISSR[14-15]、DNA Barcoding[16]等標(biāo)記技術(shù)對(duì)金銀花及其變種進(jìn)行遺傳多樣性分析，取得了顯著的效果。但上述標(biāo)記技術(shù)也存在著重現(xiàn)性差、樣品用量大、周期長、操作復(fù)雜等缺陷，未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。SSR標(biāo)記具有鑒別力高、開發(fā)成本低、操作相對(duì)自動(dòng)化、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，被普遍認(rèn)為是最接近于理想化的品種鑒定技術(shù)[17-20]。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過網(wǎng)絡(luò)可以免費(fèi)獲得海量的EST等序列信息及具有SSR掃描及引物設(shè)計(jì)功能的生物軟件，這為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供經(jīng)濟(jì)、便利的條件。

蔣超等[21]對(duì)忍冬及其變種紅白忍冬的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步了解其SSR多態(tài)性特點(diǎn)，并通過試驗(yàn)證明了SSR標(biāo)記可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。本研究通過對(duì)2種金銀花及其4種山銀花偽品進(jìn)行SSR標(biāo)記位點(diǎn)探索開發(fā)，構(gòu)建小規(guī)模的指紋圖譜，并初步應(yīng)用于金銀花種植資源遺傳多樣性分析及種質(zhì)鑒定分析。結(jié)果表明，SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。但本研究存在樣本基數(shù)小、篩選位點(diǎn)少等問題，需要進(jìn)一步從全國范圍內(nèi)擴(kuò)大種質(zhì)資源的搜集，開展大規(guī)模的EST-SSR位點(diǎn)篩選。

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