微生物與酶對水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底質(zhì)及有機(jī)碳的控制

周建忠++吳偉

摘 要：當(dāng)前我國的高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖模式造成底質(zhì)環(huán)境惡化，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，因此研究水產(chǎn)養(yǎng)殖的底質(zhì)控制和改良技術(shù)顯得非常重要和迫切。本文在參考其他方法的基礎(chǔ)上，通過利用微生物和酶來轉(zhuǎn)化池塘底泥和降低有機(jī)碳的含量，以有效控制集約化養(yǎng)殖池塘中的碳源污染。研究顯示，采用0.625 mg·cm-3的用量，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內(nèi)均對底泥的TOC有一定的降低作用。但微生物和酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其中地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、淀粉酶和纖維素酶按1∶1∶2∶1比例的組合效果最佳，對底泥TOC的降低率高達(dá)23.8%。在溫度和DO適宜的條件下，上述配方的菌酶制劑按6.75 kg·hm-2的用量，30 d內(nèi)可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有機(jī)碳含量的降低率達(dá)21.82%。研究表明，利用菌酶復(fù)合制劑對集約化養(yǎng)殖池塘進(jìn)行處理，可減少底泥的產(chǎn)生量，降低有機(jī)碳的含量，減少碳排放，且菌酶復(fù)合制劑的每公頃實際使用成本僅為825元，具有良好的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，有一定的推廣價值。

關(guān)鍵詞：微生物；酶；水產(chǎn)養(yǎng)殖；底質(zhì)；總有機(jī)碳；控制

中圖分類號：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.006

池塘養(yǎng)殖是我國淡水養(yǎng)殖的傳統(tǒng)方式，在我國的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占主導(dǎo)地位。但是，為了獲取更高的經(jīng)濟(jì)利益，養(yǎng)殖者常采用高密度、高投餌的養(yǎng)殖方式，使得養(yǎng)殖生物的代謝產(chǎn)物、殘餌等大量有機(jī)物質(zhì)沉積于池塘底部，造成底質(zhì)環(huán)境惡化。大量有機(jī)底質(zhì)的存在，不但增加了池塘的碳源，又易引發(fā)二次污染，嚴(yán)重影響水域生態(tài)環(huán)境，不利于池塘養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[1-4]。因此，有必要研究池塘養(yǎng)殖的底質(zhì)控制技術(shù)和環(huán)境改良技術(shù)，對養(yǎng)殖池塘生態(tài)環(huán)境進(jìn)行凈化和優(yōu)化，以實現(xiàn)池塘養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

近年來，我國池塘養(yǎng)殖水體底質(zhì)環(huán)境的控制和修復(fù)的各項技術(shù)發(fā)展很快，出現(xiàn)了諸如物理技術(shù)、化學(xué)技術(shù)、微生態(tài)技術(shù)及綜合技術(shù)等多種技術(shù)[5-8]。但應(yīng)用微生物菌酶技術(shù)來控制養(yǎng)殖水體中底泥及有機(jī)碳的研究尚未有報道。為了探索好氧—兼性細(xì)菌組合復(fù)配生物酶來轉(zhuǎn)化池塘底泥和降低有機(jī)碳的功能，本試驗在已完成相關(guān)菌株篩選的基礎(chǔ)上，以池塘養(yǎng)殖羅非魚為主要養(yǎng)殖模式，研究利用微生物和酶來控制有機(jī)碳的碳匯養(yǎng)殖方式，為合理有效控制集約化養(yǎng)殖池塘中的碳源提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗池塘及養(yǎng)殖生物 試驗池塘采用某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司的標(biāo)準(zhǔn)化魚類養(yǎng)殖池塘，共8個池塘，其中對照池1個，試驗池3個，設(shè)2組平行。每個池塘的面積為6 670 m2，水深1.5 m。試驗于2014年6月30日開始，7月29日結(jié)束，共計30 d，試驗期間平均水溫為（29.3±1.8） ℃。每個池塘中養(yǎng)殖的品種均為奧利亞羅非魚（Oreochromisco aureus），各池塘中養(yǎng)殖魚類的規(guī)格、數(shù)量基本一致。每667 m2放養(yǎng)的羅非魚數(shù)量為2 500尾，規(guī)格為每尾50 g左右。試驗期間養(yǎng)殖管理措施一致且不換水。

1.1.2 微生物菌株及生物酶 試驗用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心提供；淀粉酶（5 000 U·g-1）、纖維素酶（（20 000 U·g-1）由無錫杰能科生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 儀器與試劑 所用化學(xué)試劑為硫酸、硫酸汞、重鉻酸鉀、葡萄糖、氯化鈉等，均為分析純，國藥集團(tuán)上海試劑廠產(chǎn)品；牛肉膏、蛋白胨等生化試劑為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

所用儀器為pH計、ZHJH-1214雙面氣流式無菌工作臺（上海智誠公司），Autoclave SS-325型全自動高壓滅菌器（TOMY公司），MIR-153型高低溫恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司），ZHWY 200B恒溫振蕩搖床（上海智誠公司）， AL204電子分析天平（METTLER-TECEDO公司），冰箱（三星電子公司），721分光光度計（上海第三分析分析儀器廠），7530紫外分光光度計（Agilent公司），Nikon顯微鏡，全自動控溫型養(yǎng)殖系統(tǒng)等。

1.2 方 法

1.2.1 微生物菌粉的制作 地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均采用肉湯培養(yǎng)基（蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1 水1 L，調(diào)節(jié)pH值 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用）培養(yǎng)。從試管斜面上取一環(huán)菌苔，接種到10 mL滅菌的肉湯液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、100 r·min-1搖床上培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再將該菌液接入已滅菌的250 mL肉湯培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)24～48 h，當(dāng)活菌數(shù)>5×109 CFU·mL-1時，將菌液按重量比1∶4的比例吸附于超細(xì)膨潤土粉上，低溫干燥后成為菌粉，活菌含量不低于109 CFU·g-1。

1.2.2 微生物菌及生物酶組合的篩選 將養(yǎng)殖池塘的底泥取回實驗室，放入全自動控溫型養(yǎng)殖系統(tǒng)（內(nèi)含規(guī)格為100 cm×60 cm×50 cm的玻璃水族箱32個）的水族箱中，鋪滿水族箱底部，泥層厚度為（8.0±0.3） cm。同時用池塘水將底泥蓋住，上覆水層厚度為（5.0±0.2） cm，DO為（4.2±0.3） mg·L-1，環(huán)境溫度為（28±0.5） ℃。為防止試驗時水分的蒸發(fā)，每3 d用池塘水補(bǔ)足上覆水深度。將微生物菌、生物酶單獨(dú)試驗，并進(jìn)行不同的組合，設(shè)置了15個不同的處理組，詳見表1，同時設(shè)置不添加菌和酶的對照組。試驗設(shè)置2個平行，研究菌、酶及其復(fù)配物對底泥中有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化情況，篩選最適宜的菌—酶組合底質(zhì)凈化劑。

1.2.3 微生物菌及生物酶復(fù)配對養(yǎng)殖水體底泥的轉(zhuǎn)化及有機(jī)碳的影響 根據(jù)1.2.2中所篩選出的最適菌酶組合，將其應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)池塘，探究其底質(zhì)凈化的能力。為保證菌酶制劑能順利抵達(dá)并停留在底質(zhì)層面，將菌酶組合壓制成直徑為3 cm的片劑，每片的平均質(zhì)量為15 g。試驗設(shè)置3個劑量組，用量為4.50 ，6.75，9.00 kg·hm-2，同時設(shè)1個對照組。試驗設(shè)2個平行，分別在試驗開始后的0， 15， 30 d，對不同劑量微生物菌—酶組合處理后的養(yǎng)殖池塘底泥進(jìn)行取樣測試，了解養(yǎng)殖池塘底泥中有機(jī)碳的動態(tài)變化情況。同時進(jìn)行水體底泥厚度的分析，了解水體底質(zhì)環(huán)境質(zhì)量的變動情況，以便尋求最佳的微生物菌酶處理方式。試驗期間底質(zhì)有機(jī)碳的分析方法采用HJ615—2011所規(guī)定的重鉻酸鉀氧化—分光光度法[9]，底泥厚度的測量采用下探尺法直接測量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌酶組合對池塘底質(zhì)有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化

參考目前養(yǎng)殖底質(zhì)凈化劑的使用情況，試驗采用每個水族箱中添加30 g菌粉、酶或菌酶組合的用量（相當(dāng)于0.625 mg·cm-3泥的用量），應(yīng)用不同的菌、酶及其組合來處理養(yǎng)殖底泥，10 d后測定底泥中有機(jī)碳的含量，了解微生物或酶及其組合對池塘底泥的轉(zhuǎn)化情況，具體情況見表1。

由表1可見，在試驗期間，同樣使用0.625 mg·cm-3的量處理池塘底泥，由于采用的處理物質(zhì)不同，10 d后底泥中的總有機(jī)碳含量明顯不同，TOC的去除率相差較大。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內(nèi)均對底泥的TOC有一定的去除作用，去除率在4.0%～7.4%。但微生物菌與菌組合或酶與酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其對TOC的去除率為10.0%～15.9%。而微生物菌與生物酶的組合效果則更優(yōu)異，其不同組合對TOC的去除效果在10.5%～23.8%，特別是地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1組合）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達(dá)23.8%。這主要與菌酶的不同性質(zhì)有密切關(guān)系。地衣芽孢桿菌是兼性細(xì)菌，好氧、微氧條件下均可生長，枯草芽孢桿菌是好氧細(xì)菌[10]，故其兩者組合具有在不同DO水平下的作用效果，并且比好氧條件下效果更好。本試驗中因底泥層較薄，上覆水較淺，DO相對較高，為（4.2±0.3） mg·L-1，故效果顯著。同時，由于養(yǎng)殖池塘底質(zhì)受飼料殘留影響較大，殘餌中碳水化合物（糖類）的含量高達(dá)62%[11]，故淀粉酶的效果較好。因本試驗是在底泥離開池塘的條件下開展的，僅針對微生物—酶的效果篩選，故尚需在池塘中進(jìn)行驗證試驗。

2.2 微生物菌粉及生物酶復(fù)配對養(yǎng)殖水體底泥的轉(zhuǎn)化及有機(jī)碳的影響

采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的處理用量處理養(yǎng)殖水體中的底泥30 d，每隔15 d取樣分析養(yǎng)殖池塘底泥的厚度及有機(jī)碳TOC的含量，考察微生物—酶組合在控制養(yǎng)殖池塘底泥有機(jī)碳中的應(yīng)用效果。不同試驗組的池塘底質(zhì)環(huán)境情況見圖1和圖2。

由圖1和圖2可見，將菌酶復(fù)合制劑按不同的用量加入養(yǎng)殖池塘后，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機(jī)碳含量在下降，導(dǎo)致了底泥厚度的降低。其中4.50 kg·hm-2試驗組的效果明顯不如另外2個試驗組，但6.75 kg·hm-2和9.00 kg·hm-2試驗組的效果并無顯著性差異?？紤]到經(jīng)濟(jì)有效性，選擇菌酶制劑的用量以6.75 kg·hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75 kg·hm-2試驗組經(jīng)30 d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有機(jī)碳的去除率達(dá)21.82%，對控制池塘底泥的發(fā)生及碳素的釋放具有顯著的功效。

微生物和酶的作用需要有一定的溫度和DO作保證，本試驗的水溫維持在28～31 ℃，底層水體的DO水平在3.2～3.8 mg·L-1間，滿足了不同特性微生物的生長和酶的催化活性，故對底泥及TOC的控制效果較好。

因本試驗是在養(yǎng)殖池塘中進(jìn)行，無法隨意地控制DO，因此對限制微生物和酶作用效果的最低DO水平無法評估，需要在以后的研究中加以完善。

2.3 菌酶復(fù)合制劑的經(jīng)濟(jì)效益分析

為使本研究的研究成果具有推廣價值，故對使用菌酶復(fù)合制劑的經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行分析和評估。上述試驗表明，用于處理池塘底泥污染的菌酶制劑的適宜用量為6.75 kg·hm-2，30 d內(nèi)具有較顯著的效果。如果每30 d使用1次，1個養(yǎng)殖季節(jié)（以6個月計）1公頃水面的池塘用量為40.5 kg。根據(jù)實際的比例，其中淀粉酶為16.2 kg、纖維素酶8.1 kg、地衣芽孢桿菌8.1 kg 、枯草芽孢桿菌8.1 kg 。其中的主要成本來自2個酶，淀粉酶的價格為每28元·kg-1，纖維素酶為35元·kg-1。而菌粉成本相對較低，僅為5元·kg-1。故菌酶復(fù)合制劑在一個養(yǎng)殖季節(jié)中的實際使用成本僅為825元·hm-2，遠(yuǎn)低于目前的化學(xué)性底質(zhì)改良劑使用成本。

試驗結(jié)果表明，利用菌酶復(fù)合制劑對集約化養(yǎng)殖池塘進(jìn)行處理，可減少底泥的產(chǎn)生量，降低有機(jī)碳的含量，減少碳排放，具有良好的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，有一定的推廣價值。

3 結(jié) 論

（1）采用0.625 mg·cm-3的用量，應(yīng)用不同的菌酶組合處理養(yǎng)殖底泥，10 d后測定底泥中有機(jī)碳的含量。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10 d內(nèi)均對底泥的TOC有一定的去除作用。但微生物和酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其中地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達(dá)23.8%。

（2）采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的處理用量處理養(yǎng)殖水體中的底泥30 d，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機(jī)碳含量在下降，導(dǎo)致了底泥厚度的降低。菌酶制劑的用量以6.75 kg·hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75 kg·hm-2試驗組經(jīng)30 d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，與對照組相比TOC的去除率達(dá)21.82%，對控制池塘底泥的發(fā)生及碳素的釋放具有顯著的功效。

（3）利用菌酶復(fù)合制劑對集約化養(yǎng)殖池塘進(jìn)行處理，可減少底泥的產(chǎn)生量，降低有機(jī)碳的含量，減少碳排放，且菌酶復(fù)合制劑的實際使用成本僅為825元·hm-2，具有良好的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，有一定的推廣價值。

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