蕨菜總黃酮的提取及抗氧化性

陳燕芹　劉紅　蔡麗

摘要：為了探明蕨菜中黃酮類物質(zhì)提取工藝及其抗氧化性，為進一步開發(fā)利用蕨菜提供依據(jù)。以蕨菜為原料，采用單因素試驗和正交試驗，研究了超聲波提取溫度、提取時間、乙醇濃度、料液比等工藝參數(shù)對蕨菜總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，蕨菜總黃酮的超聲提取工藝為：料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取溫度70 ℃、提取時間20 min、乙醇濃度80%，該條件下提取率為245%。蕨菜總黃酮的抗氧化性隨著濃度的升高而增強，當總黃酮濃度為089 mg/L時，對羥基自由基清除率達到651%；當總黃酮濃度為1115 mg/L時，對DPPH自由基的清除率達到865%。

關鍵詞：蕨菜；黃酮；超聲提取；正交試驗；提取工藝；抗氧化性

中圖分類號： TS2073；R2842文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0299-03

野生蕨菜在自然界中廣泛分布于荒坡，林緣、稀疏針闊葉和灌木叢中，以未展開的葉柄供食，其味道鮮美，質(zhì)地脆嫩，營養(yǎng)豐富，清香適口，是廣大群眾喜食的一種山野菜，被當今國內(nèi)外營養(yǎng)學家譽為森林蔬菜，是市場的暢銷品[1]。蕨菜全株均可入藥，有很高的藥用價值，有固表止汗、消熱解毒、強健脾胃、降氣化痰、潤腸驅(qū)蟲的功效，可治療高血壓、頭暈失眠、脫肛、痢疾等，雖然人類食用蕨菜的歷史悠久，但對其深入研究較少。

黃酮類物質(zhì)在醫(yī)學上有很大醫(yī)用價值，現(xiàn)已成為藥學和保健食品學的研究熱點，醫(yī)學界普遍認為黃酮類物質(zhì)具有抗氧化性，能消除體內(nèi)過多的自由基，從而在抗衰老、抗腫瘤和糖尿病的治療方面有較大的醫(yī)用價值，此外黃酮還具有改善心腦血管循環(huán)、降低血清膽固醇、解痙抗過敏等方面的作用。研究結(jié)果表明蕨菜黃酮類物質(zhì)在消除體內(nèi)過多自由基方面有良好的作用。本試驗對蕨菜中總黃酮的超聲提取工藝進行研究，并對其抗氧化性進行探討，以期為蕨菜功能成分的研究開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

11儀器與試劑

電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A，上海秼馬恒溫設備廠產(chǎn)品，電磁式礦石粉碎機（DF-4，杭州卓馳有限公司產(chǎn)品，超純水機（UPT-II-40L，成都超純水有限公司產(chǎn)品，電子分析天平（BSA224S，德國賽多利斯公司產(chǎn)品，紫外可見分光光度計（Cary 50，美國瓦里安公司產(chǎn)品。

蕨菜（采自畢節(jié)陽山公園；蘆?。▏幖瘓F化學試劑有限公司產(chǎn)品，98%；無水乙醇、硫酸亞鐵、鹽酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、水楊酸、雙氧水、DPPH等試劑均為國產(chǎn)分析純。

12方法

121樣品制備

蕨菜樣品用自來水清洗后，再用超純水洗滌多次，在80 ℃烘干24 h后，用粉碎機粉碎并過80目篩，置于干燥器中備用。

122蘆丁標準曲線繪制

準確稱取220 mg蘆丁用30%的乙醇配制成022 mg/mL標準溶液，分別準確吸取標準蘆丁溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于25 mL容量瓶中。依次加入5 mL 30%乙醇溶液、1 mL 5% NaNO2溶液，靜置5 min后，加1 mL 10% Al（NO33溶液，靜置6 min后，加入5 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容，靜置10 min后，在波長為5091 nm處測出標準系列的吸光度，繪制標準曲線。得標準曲線方程為D=10738 6x+0019 4，線性相關系數(shù)為0999 7。

123蕨菜總黃酮含量的測定

準確稱取05 g蕨菜粉末于50 mL磨口錐形瓶中，加入一定量乙醇，在一定溫度下超聲波輔助提取一定時間，趁熱減壓抽濾，用30%乙醇定容于 50 mL 容量瓶中，作為待測液。然后，取上述溶液5 mL于 25 mL 容量瓶中，加入5% NaNO2 1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10% Al（NO33 1 mL，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH 10 mL，用30%乙醇定容。15 min后在5091 nm處測定吸光度D，以試劑作空白參比。

[J]Y=[SX（]C×25×10m×1 000[SX]×100%。

式中：m為樣品質(zhì)量；C為黃酮溶液濃度；Y為黃酮得率，10為所取溶液的倍數(shù)。

124各因素對蕨菜總黃酮提取率的影響

乙醇濃度，在料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超聲溫度60 ℃、超聲時間20 min的條件下改變乙醇濃度（60%、70%、75%、80%、90%，確定乙醇濃度對蕨菜總黃酮提取率的影響。

料液比，在乙醇濃度80%、超聲溫度60 ℃、超聲時間20 min的條件下改變料液比（1 ∶[G-3]30、1 ∶[G-3]40、1 ∶[G-3]45、1 ∶[G-3]50、1 ∶[G-3]60，g ∶[G-3]mL，測定料液比對蕨菜總黃酮提取率的影響。

超聲溫度，在乙醇濃度80%、料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超聲時間 20 min 條件下改變超聲溫度（30、40、50、60、65、70 ℃，測定超聲溫度對蕨菜總黃酮提取率的影響。

超聲時間，在乙醇濃度80%、料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超聲溫度 60 ℃ 的條件下改變超聲時間（5、8、10、20、30、40 min，測定超聲時間對蕨菜總黃酮提取率的影響。

125正交試驗優(yōu)化蕨菜總黃酮提取工藝

在單因素試驗的基礎上，以蕨菜為材料，以超聲波作用時間、料液比、乙醇濃度、溫度為主要因素，采用L9（34正交表設計正交試驗，以確定蕨菜中總黃酮的最佳提取工藝條件，各因素水平見表1。

126蕨菜總黃酮抗氧化性的測定

[CM（26]1261對·OH的清除率采用水楊酸比色法測定黃酮[CM]

[F（W7][HT6H][J][WTH]表1L9（34正交試驗因素水平[HTSS][STB][WTB]endprint

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W3，W26W]水平[B（][BHDWG12，W26W]因素

[BHDWG3，W62。4W]A：乙醇濃度（%B：料液比（g ∶[G-3]mLC：時間（minD：溫度（℃[BW]

[BHDG12，W3，W62。4W]1751 ∶[G-3]401060

[BHDW]2801 ∶[G-3]452065

3901 ∶[G-3]503070[HJ][BG）F][F）]

對羥基自由基的清除作用。分別取黃酮提取液005、01、02、04、06、08 mL于試管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2 2 mL，搖勻后靜置10 min。加入 6 mmol/L 水楊酸2 mL，搖勻后靜置30 min，在510 nm波長下測定吸光度，記為Di；用水代替水楊酸測定某濃度黃酮溶液的本底光密度Dj；用水代替抗氧化劑時測定的空白對照光密度為D[5]。

[J]清除率（S=[1-（Di-Dj/D]×100%。

1262 對DPPH的清除率[6]利用最優(yōu)化方案提取的總黃酮溶液，配制不同濃度的樣品溶液，分別取20 mL，再加入到5 mL容量瓶中，分別加入濃度為004 mg/mL的DPPH 溶液 20 mL，混合搖勻，反應30 min 后在520 nm 處測定其吸光度D1。以20 mL無水乙醇代替DPPH的吸光度為D2，以 20 mL 的蒸餾水代替樣品溶液的吸光度為D0，以無水乙醇作參比液[6]。DPPH自由基清除率=[1-（D1-D2/D0]×100%。

2結(jié)果與分析

21不同因素對蕨菜總黃酮提取率的影響

211乙醇濃度由圖1-A可知，在其他條件不變時，蕨菜總黃酮提取率開始隨乙醇濃度的增大而增加，而當乙醇濃度達到80%時，總黃酮的提取率最大；當乙醇濃度再增大時，總黃酮提取率逐漸下降。

212超聲波提取時間蕨菜中總黃酮的提取率在提取 10 min 之前，隨時間增加而提高，至10 min時達到最大值（圖1-B。

213料液比由圖1-C可見，蕨菜中總黃酮的提取率在料液比為1 g ∶[G-3]40 mL時達到最大，繼續(xù)增加溶劑，總黃酮的提取率反而下降。

214提取溫度蕨菜中總黃酮的提取率隨溫度的增加逐漸增加，在60 ℃之前隨溫度的增加提取率的增加較快，而后隨溫度增加提取率也逐漸增加，但增加趨勢較緩慢（圖1-D。

22最佳提取工藝

正交試驗結(jié)果（表2表明，從極差分析可以看出，在影響蕨菜中總黃酮提取率的4個因素中，料液比>溫度>時間>乙醇濃度。最佳的提取工藝條件為：A2B2C2D3，即料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取溫度70 ℃、提取時間20 min、乙醇濃度80%。用最佳工藝進行3次平行試驗，得平均提取率為245%。

23蕨菜總黃酮對·OH的清除能力

蕨菜總黃酮對·OH的清除結(jié)果見圖2。由圖2可知，添加不同濃度的蕨菜總黃酮，對·OH均有清除作用，隨樣品濃度的增大，抗氧化性有較明顯增大，當樣品濃度為089 mg/L[FL]

[F（W17][TPCYQ1tif][F]

[FL（22]

時，抑制率最高，為651%，此后增加樣品濃度抑制率不再增大。

[F（W17][HT6H][J]表2蕨菜總黃酮提取正交試驗結(jié)果[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W4，W20，W5W]試驗號[B（][BHDWG12，W20W]因素

[BHDWG3，W5。4W]A：乙醇濃度B：固液比C：時間D：溫度提取率（%

24蕨菜總黃酮對DPPH·的清除能力

由圖3可知，蕨菜總黃酮具有清除DPPH自由基的作用，其清除能力隨著濃度的增加而增大，當總黃酮濃度為 1115 mg/L 時，清除率為865%，再增加黃酮濃度，清除率變化不大。黃酮濃度與維生素C濃度相同時，蕨菜總黃酮的清除能力與維生素C相當。

[F（W10][TPCYQ3tif][F]

3結(jié)論

試驗結(jié)果表明，超聲輔助法中提取因素對蕨菜總黃酮提取率的影響順序為料液比>溫度>時間>乙醇濃度，最佳提取工藝條件為：料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取溫度70 ℃、提取時間 20 min、乙醇濃度80%，最佳工藝下的平均提取率為245%。

自由基清除試驗結(jié)果表明，蕨菜總黃酮具有一定的抗氧化性，且隨著濃度的增加而逐漸增加。當總黃酮濃度為 089 mg/L 時，羥基自由基清除率達651%，當總黃酮濃度為1115 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為865%。endprint