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    枯草桿菌啟動子43及amy的轉錄活性

    2015-04-02 00:54:00張婷婷馬磊
    江蘇農業(yè)科學 2014年12期
    關鍵詞:基因表達

    張婷婷 馬磊

    摘要:利用報告基因β-半乳糖苷酶,分析了枯草桿菌啟動子43及amy的轉錄活性。結果表明,在基本培養(yǎng)基條件下,啟動子43在對數(shù)前期開始表現(xiàn)轉錄活性,隨菌量增大活性迅速提高,穩(wěn)定期逐步平穩(wěn);在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下,啟動子43轉錄活性在對數(shù)前期與基本培養(yǎng)基條件下相似,在對數(shù)期轉錄活性增加速率則高于基本培養(yǎng)基條件下的增加速率;啟動子43轉錄活性在E coli和B subtilis體內基本一致。啟動子amy在淀粉誘導下轉錄活性較高,在添加葡萄糖以及無誘導條件下酶活較低。

    關鍵詞:枯草桿菌;啟動子;轉錄活性;基因表達

    中圖分類號: Q933文獻標志碼: A

    文章編號:002-302(204)2-0056-02

    啟動子是實現(xiàn)外源基因高效表達的關鍵,是表達載體的核心成分,啟動子的轉錄活性分析是表達載體構建工作的重點之一。在枯草桿菌中常見啟動子重疊和串連現(xiàn)象,例如RNA聚合酶σ43(σA)和σ37(σB)的識別區(qū)在胞嘧啶脫氨酶基因啟動子43序列內重疊[2]。σ43負責營養(yǎng)期的基因起始轉錄,而σ37負責對數(shù)晚期和平臺期早期的基因起始轉錄,因而啟動子43可在多個時期起始轉錄,是理想的發(fā)酵工程啟動子[3- 4]。本研究應用報告基因β-半乳糖苷酶基因(bgaB),分析啟動子43及枯草桿菌α-淀粉酶基因啟動子amy的轉錄活性,為進一步開發(fā)高效表達系統(tǒng)奠定基礎。

    材料和方法

    材料

    [2]菌株B subtilis A747和E coli DH5α購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;質粒pEB-bgaB為筆者所在實驗室構建,該質粒為大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體,攜帶β-半乳糖苷酶基因(bgaB)。限制性核酸內切酶、堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購自romage公司,Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶購自寶生物公司,質粒提取、DNA回收試劑盒購自杭州維特潔公司。

    2方法

    2引物設計根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中B subtilis基因組上的43和amy序列設計引物,43片段擴增后保留其原有起始密碼子(ATG),上下游引物分別為5′-[ZZ(Z]CCGGATCC[ZZ)]TTGTAGAGCTCAGCAT-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)和5′-GG[ZZ(Z]CTGCAG[ZZ)]CATGTGTACATTCCTC-3′(下劃線為stⅠ酶切位點);amy片段擴增后保留了原有信號肽序列,上下游引物分別為5′-AA[ZZ(Z]GGATCC[ZZ)]GCTCATGCCGAGAATAGAC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)和5′-AT[ZZ(Z]CTGCAG[ZZ)]TTCAGCACTCGCAGCCG-3′(下劃線為stⅠ酶切位點)。CR擴增條件:92 ℃變性30 s,60 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)30次。

    22[2]載體構建在載體pEB-bgaB上bgaB 5′端的BamHⅠ[2]和stⅠ酶切位點之間,分別插入經(jīng)回收并酶切的CR產物43和amy,獲得質粒pEB-43-bgaB和pEB-amy-bgaB;載體構建成功后,啟動子片段43和amy可起始轉錄bgaB。載體電轉入E coli DH5α后,將感受態(tài)細胞涂布在含X-gal平板,挑選8 h內出現(xiàn)明顯藍色菌落,提取質粒,酶切鑒定。挑取單菌落搖菌,測定整個生長時期β-半乳糖苷酶活性。

    23β-半乳糖苷酶活性測定方法和定義[5]將一定體積菌液離心收集菌體,重懸于700 μL Z-buffer(006 mol/L Na2HO4·7H2O,004 mol/L NaH2O4,00 mol/L KCl,000 mol/L MgSO4·7 H2O和005 mol/L β-巰基乙醇,pH值70),加入0 μL Triton X 00(0%)和溶菌酶0 μL[3](0 g/L),靜止30 min后加入鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONG)200 μL(4 g/L),混勻后置于55 ℃水浴5 min,加入[4]Na2CO3 500 μL( mol/L)終止反應,離心,取上清并測量其D420 nm。

    酶活性(U)=[SX(]D420 nm× 000D595 nm×5(min)×V[SX)](D595 nm為測前菌液吸光度;V為所用菌液的體積,mL)。

    2結果與分析

    CR擴增獲得的43片段大小在250~500 bp之間,amy片段大小在500~750 bp之間(圖),與預計大小相符。

    在基本培養(yǎng)基(胰蛋白胨%,酵母提取物05%,氯化鈉%)條件下,E coli DH5α(pEB-43-bgaB)合成的β-半乳糖苷酶活性在對數(shù)前期開始表現(xiàn),隨著菌量增大活性迅速提高,穩(wěn)定期后逐步平穩(wěn),最高可達6 650 U,穩(wěn)定期后隨菌群衰退酶活下降(圖2)。在富營養(yǎng)培養(yǎng)基(胰蛋白胨2%,酵母提取物%,氯化鈉%)條件下,E coli DH5α(pEB-43-bgaB)[CM(233]合成的 β-半乳糖苷酶活性在對數(shù)前期與基本培養(yǎng)基[CM)]

    [FK(W2][TZTTtif][FK)]

    的結果相似,進入穩(wěn)定期酶活性增加速率則逐漸超過在基本培養(yǎng)基中速率,最高為9 200 U(圖2)。

    [FK(W0][TZTT2tif][FK)]

    B subtils(pEB-43-bgaB)在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下,β-半乳糖苷酶活性與E coli DH5α(pEB-amy-bgaB)在在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下相似,對數(shù)前期開始表現(xiàn),隨著菌量增長活性迅速提高,穩(wěn)定期后逐步平穩(wěn),最高可達9 550 U,在穩(wěn)定期后隨著菌群衰退酶活性下降(圖3)。

    [FK(W0][TZTT3tif][FK)]

    E coli DH5α(pEB-amy-bgaB)在添加%可溶性淀粉誘導條件下,β-半乳糖苷酶活性可達 000 U;而在添加%葡萄糖以及無誘導條件下酶活很低,最高只有30 U。B subtils(pEB-amy-bgaB)在無誘導條件下β-半乳糖苷酶活性略高(750 U)。

    3討論

    本研究通過檢測β-半乳糖苷酶活性,研究了啟動子43及amy在B subtils和E coli中的轉錄活性。本研究發(fā)現(xiàn)43轉錄合成的β-半乳糖苷酶活性,在(pEB-43-bgaB)和(pEB-43-bgaB)中的結果相似,對數(shù)前期開始表現(xiàn),隨著菌量增長活性迅速提高,穩(wěn)定期逐步平穩(wěn),同樣在穩(wěn)定期后隨著菌群衰退,酶活性下降。在B subtils(pEB-43-bgaB)中β-半乳糖苷酶活性可達9 500 U以上。本研究結果與Ye等在質粒pUB0基礎上,以枯草桿菌WB700為宿主菌,利用43啟動子和果聚糖蔗糖酶信號肽,在普通培養(yǎng)條件下分泌表達葡萄球菌激酶的結果基本一致[6]。啟動子43在E coli中,β-半乳糖苷酶轉錄的水平可達9 200 U,這可能是由于E coli RNA聚合酶σ70與B subtils σ43具有同源性[6-0],能夠識別結合啟動子43,使之在E coli中同樣能轉錄。因而可利用啟動子43先在E coli中表達檢測外源基因,再轉入B subtils中表達。

    序列分析比對發(fā)現(xiàn)43序列與σ43和σ37的識別序列并不完全保守,σ43和σ37識別序列的保守性顯然與啟動子的高活性不相符。因而Wang等推測在σ43和σ37識別序列之外還存在其他能夠影響啟動子活性的因素[8]。在本實驗室,另一研究將啟動子43的核糖體結合序列刪除后,替換上原核典型的核糖體結合序列,發(fā)現(xiàn)其轉錄效率仍然較高,說明影響因素可能不是核糖體結合序列。

    本研究發(fā)現(xiàn)不同營養(yǎng)條件可影響啟動子43的轉錄活性。對數(shù)前期,在基本培養(yǎng)基和富營養(yǎng)條件下啟動子43的轉錄活性差異不大;進入穩(wěn)定期后,出現(xiàn)差距,43在基本培養(yǎng)基轉錄表達的β-半乳糖苷酶活性增長逐漸進入了平穩(wěn)期,而富營養(yǎng)條件下其活性增長率依然很高,持續(xù)向上增長。這種差異可能由于啟動子43轉錄效率較高與合成mRNA及蛋白質原料有限之間的矛盾引起。對數(shù)前期及對數(shù)期,菌量小,營養(yǎng)充足,差異不明顯,進入穩(wěn)定期后,隨著菌群擴大及啟動子43高效率轉錄,營養(yǎng)矛盾造成的差異逐步突出,因而優(yōu)化營養(yǎng)條件有助于提高啟動子43的轉錄活性。

    啟動子amy在E coli中轉錄活性較低,β-半乳糖苷酶活性在誘導條件下最高為 000 U?;钚匀醯脑蚩赡苁请m然啟動子amy也是由B subtils RNA聚合酶σ43識別轉錄,但對E coli的σ70因子親和性低,因而在E coli中轉錄水平低;另一原因也可能是攜帶α-淀粉酶的信號肽的β-半乳糖苷酶融合元,在E coli胞內未能切除信號肽,以無活性的蛋白形式存在。啟動子amy在B subtils中轉錄活性本身可能就不太高,Gat以綠色熒光蛋白為報告基因,利用B subtils WB600和pUB0衍生載體,發(fā)現(xiàn)amy活性較低。因此amy的序列還有待改造提高其活性。

    [HS2][HT85H]參考文獻:[HT8SS]

    [ZK(#]徐友強,馬翠卿,陶飛,等 細菌啟動子識別及應用研究進展 生物工程學報,200,26(0):393-403

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    [3]Blombach B, Eikmanns B Current knowledge on isobutanol production with Escherichia coli,Bacillus subtilis and Corynebacterium glutamicum Bioengineered,20,2(6):346-350

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