HPLC法測定二氮嗪注射液的含量

劉玉含，張連成，王超眾，賈首時(shí)（1.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161005；.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161006）

二氮嗪注射液在臨床常用于治療高血壓危象、高血壓腦病、幼兒特發(fā)性低血糖、胰島細(xì)胞瘤引起的嚴(yán)重低血糖病、痛經(jīng)和流產(chǎn)等癥[1]，但對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤或單胺氧化酶抑制劑引起的高血壓無效[2]。二氮嗪注射液收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》（第3冊(cè)）[3]，采用紫外分光光度（UV）法測定其含量，方法操作簡便，但專屬性較差，含量結(jié)果易受溶劑和輔料的干擾。為此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]，以氫氯噻嗪為內(nèi)標(biāo)物，建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測定二氮嗪注射液含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695e型HPLC儀，包括2489紫外-可見光檢測器和Empower工作站（美國Waters公司）；SK2510HLC型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）；BP221S電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

二氮嗪注射液（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：131002、130907、130418，規(guī)格：20 ml∶0.3 g；北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130317、130712、130509，規(guī)格：20 ml∶0.3 g）；二氮嗪對(duì)照品（上海博頓生物化工有限公司，批號(hào)：100203-201301，純度：99.95%）；氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)物（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100309-201103）；甲醇為色譜純，庚烷磺酸鈉為色譜級(jí)，醋酸為優(yōu)級(jí)純，水為二次蒸餾的純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)物15 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密量取本品2 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，加入“2.2.1”項(xiàng)下氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液 精密稱取二氮嗪對(duì)照品15 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，加入“2.2.1”項(xiàng)下氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 空白輔料溶液 取按二氮嗪處方中不含二氮嗪的輔料適量制成溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters symmetry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉-甲醇-醋酸（79∶20∶1，V/V/V）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。分別取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白輔料溶液各20 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)以二氮嗪峰計(jì)為4 500，分離度＞1.5。色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜法圖A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.空白輔料溶液；1.氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)物；2.二氮嗪Fig 1 HPLC ChromatogramsA.reference solution；B.test solution；C.blank solution；1.diazoxi-de；2.Internal standard of hydrochlorothiazide

精密量取二氮嗪對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為1.5 mg/ml的溶液，分別精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，置于10 ml量瓶中，再分別精密加入“2.1.1”項(xiàng)下氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液0.5 ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含二氮嗪質(zhì)量濃度為0.030、0.060、0.090、0.120、0.150 mg/ml及含氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝47.76x+0.085 3（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，二氮嗪的質(zhì)量濃度在0.030～0.110 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.1.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μl，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.68%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：131002）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫與冷藏4 ℃條件下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，二氮嗪在室溫放置12 h的RSD為0.95%（n＝6），冷藏4 ℃放置12 h的RSD為0.79%（n＝6），表明供試品溶液在室溫與冷藏4 ℃條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定性均較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：131002）2 ml（約相當(dāng)于二氮嗪30 mg），共6份，分別置于100 ml量瓶中，加甲醇適量并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，分別置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.68%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：131002）適量，共9份，分別精密加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的二氮嗪對(duì)照品各適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

取6批樣品各適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量結(jié)果，并與筆者在試驗(yàn)前期采用UV法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV法測定的結(jié)果高于HPLC法，表明HPLC法測定時(shí)可排除輔料等因素的干擾，方法更為準(zhǔn)確，詳見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

表2 樣品含量測定結(jié)果（%，n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（%，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者將二氮嗪用流動(dòng)相溶解制成每1 ml含90 μg的溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氮嗪在254 nm波長處有最大吸收，故將檢測波長確定為254 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

筆者比較了多種流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液、甲醇-水）對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)考慮到二氮嗪和氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)物均具有弱堿性，因此采用離子對(duì)試劑庚烷磺酸鈉加入流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)選擇0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液-甲醇-醋酸（79∶20∶1，V/V/V）為流動(dòng)相時(shí)，二氮嗪和氫氯噻嗪峰形尖銳對(duì)稱，且出峰時(shí)間短。

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)采用UV法測定了二氮嗪的含量，該方法易受到輔料等因素的影響，測定的結(jié)果不能真實(shí)地反映二氮嗪的含量。而HPLC法專屬性強(qiáng)，加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)后可以校準(zhǔn)和消除由于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，可提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，更適用于二氮嗪的含量測定。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確，專屬性好，精密度高，可用于二氮嗪注射液的質(zhì)量控制。

[1]何柯，胡蘊(yùn)，劉好，等.二氮嗪與糖尿病[J].臨床薈萃，2014，29（2）：220.

[2]李少民，成少利，萬俊哲，等.二氮嗪防治低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（5）：28.

[3]國家藥典委員會(huì).國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)：第3冊(cè)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：11.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅤD、附錄ⅣA.