續(xù)骨沖和膏的質量標準研究

吳鳳榮，曾聰彥，胡玉良，盧建業(yè)（.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東中山 5840；.廣東藥學院中藥學院，廣東中山 58400）

續(xù)骨沖和膏由大黃、赤芍、當歸、續(xù)斷、黃柏、獨活等20味中藥制備而成，是廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院的常用經驗方，具有活血通絡、消腫止痛、療傷續(xù)骨的功效，主要用于治療跌打瘀傷。由于該制劑尚未建立完善的質量標準，為了控制其產品質量，保證其安全性和有效性，本研究采用薄層色譜（TLC）法對該制劑中的大黃、黃柏、赤芍、當歸、骨碎補、獨活、荊芥、木香等多味藥進行了定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對制劑中的君藥大黃所含的大黃素和大黃酚進行了含量測定。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀（美國安捷倫公司）；KQ3200E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S型電子天平（德國賽多利斯公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海衡平儀器儀表廠）；TC-15型套式恒溫器（浙江新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 藥品與試劑

續(xù)骨沖和膏（批號：20131109、20131202、20140108）由廣東省中山市中醫(yī)院制劑室提供；大黃素（批號：110756-200110）、大黃酚（批號：110796-201118）、芍藥苷（批號：110736-201136）對照品及黃柏（批號：121510-201105）、大黃（批號：121249-201003）、赤芍（批號：121093-200402）、當歸（批號：120927-201315）、骨碎補（批號：121169-200503）、獨活（批號：120940-201111）、木香（批號：120921-201008）、荊芥（批號：120911-201110）對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G（青島海洋化工有限公司分廠，批號：20120208）；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 大黃[1]取本品1.5 g，用玻璃棒分散，加甲醇20 ml，浸泡1 h，濾過，取濾液5 ml，蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，加鹽酸1 ml，水浴加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分2次振搖提取，每次20 ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇20 ml，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取缺大黃的其余藥味適量，按處方工藝制成缺大黃的陰性對照品，取約1.5 g，按上述供試品溶液的制備方法制成缺大黃的陰性對照溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各5 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，分別置于日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)榧t色。大黃的TLC圖見圖1。

2.1.2 黃柏[2-3]取本品3 g，用玻璃棒分散，加1%醋酸甲醇溶液20 ml，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。取黃柏對照藥材0.1 g，加1%醋酸甲醇20 ml，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取缺黃柏的其余藥味制成的陰性對照品3 g，按上述供試品溶液的制備方法制成缺黃柏的陰性對照溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5 μl及對照藥材溶液1 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的黃色斑點和熒光斑點。黃柏的TLC圖見圖2。

圖1 大黃的TLC圖A.熏氨蒸氣前；B.熏氨蒸氣后；C.紫外光燈下；1～3.供試品；4.大黃對照藥材；5缺大黃的陰性樣品Fig 1 TLC of Rhei RadixA.before fumed with ammonia vapor；B.after fumed with ammonia vapor；C.under UV lamp；1-3.test samples；4.Rhei Radix reference substance；5.negative control without Rhei Radix

圖2 黃柏的TLC圖A.日光下；B.紫外光燈下；1～3.供試品；4.黃柏對照藥材；5.缺黃柏的陰性樣品Fig 2 TLC ofP.chineseA.under sunlight；B.under UV lamp；1-3.test samples；4.Phellodendri Chinensis reference substance；5.negative control withoutP.chinese

2.1.3 赤芍[4]取本品22 g，用玻璃棒分散，加乙醇50 ml，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。取赤芍對照藥材0.5 g，加乙醇10 ml，按上述供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取缺赤芍的其余藥味制成的陰性對照品22 g，按上述供試品溶液的制備方法制成缺赤芍的陰性對照溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各5 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色熒光斑點。赤芍的TLC圖見圖3。

2.1.4 當歸[5]取本品22 g，加乙醚50 ml，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）處理10 min，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取當歸對照藥材0.5 g，加乙醚20 ml，按上述供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取缺當歸的其余藥味制成的陰性對照品22 g，按上述供試品溶液的制備方法制成缺當歸的陰性對照溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。當歸的TLC圖見圖4。

圖3 赤芍的TLC圖1～3.供試品；4.赤芍對照藥材；5.芍藥苷對照品；6.缺赤芍的陰性樣品Fig 3 TLC of Paeoniae Radix Rubra1-3.test samples；4.Paeoniae Radix Rubra reference substance；5.peoniflorin control；6.negative control without Paeoniae Radix Rubra

圖4 當歸的TLC圖1～3.供試品；4.當歸對照藥材；5.缺當歸的陰性對照品Fig 4 TLC ofA.sinensis1-3.test samples；4.Angelicae Sinensis Radix reference substance；5.negative control withoutA.sinensis

2.1.5 木香[6]取本品20 g，加甲醇40 ml，用玻璃棒分散，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）處理30 min，濾過，取濾液濃縮至2 ml，作為供試品溶液。取木香對照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取缺木香的其余藥味制成的陰性對照品0.5 g，按上述供試品溶液的制備方法制成缺木香的陰性對照溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各5 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（5∶3∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。木香的TLC圖見圖5。

2.2 大黃素和大黃酚的含量測定[7-8]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Boston Green ODS C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15，V/V）；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm。理論板數(shù)按大黃素、大黃酚峰計應不低于3 000。

2.2.2 供試品溶液的制備[1]精密稱取本品約3 g，置于100 ml錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定質量，加熱回流提取30 min，放冷，再次精密稱定，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置圓底燒瓶中，揮干溶劑，加水15 ml使溶解，再加鹽酸1 ml，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）處理5 min，加熱回流提取30 min，立即冷卻，置于分液漏斗中。用少量乙醚洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，用乙醚分3次振搖提取，每次15 ml，合并乙醚液，蒸干。殘渣加甲醇使溶解，轉移至25 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖5 木香的TLC圖1～3.供試品；4.木香對照藥材；5.缺木香的陰性對照品Fig 5 TLC ofA.lappa1-3.test samples；4.Aucklandiae Radix reference substance；5.negative control withoutA.lappa

2.2.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取大黃素、大黃酚對照品各適量，加甲醇制成每1 ml含48.25 μg大黃素和109 μg大黃酚的混合對照品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，按續(xù)骨沖和膏的處方工藝制成缺大黃的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成缺大黃的陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應保留時間處，有相同的色譜峰；陰性對照無干擾。色譜見圖6。

圖6 高效液相色譜圖A.供試品；B.混合對照品；C.陰性對照；a.大黃素；b.大黃酚Fig 6 HPLC chromatogramsA.test sample；B.mixed control；C.negative control；a.emodin；b.chrysophanol

2.2.6 線性關系考察 精密量取“2.2.3”項下的混合對照品溶液0.5、1、2、4、8 ml，分別用甲醇稀釋，得到系列濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液各20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得大黃素的回歸方程為y＝72.876x－30.738（r＝0.999 9），大黃酚的回歸方程為y＝62.82x－57.904（r＝0.999 9）。結果表明，大黃素和大黃酚的質量濃度分別在2.41～38.6、5.45～87.2 μg/ml范圍內與各自峰面積呈良好線性關系。

2.2.7 精密度試驗 精密稱取續(xù)骨沖和膏（批號：201301202）樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄峰面積。結果，大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.3%、1.2%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批供試品溶液各適量，分別于配制0、2、4、6、8 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.08%、1.53%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 稱取同一批次的續(xù)骨沖和膏（批號：201301202）共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量。結果，大黃素和大黃酚的平均含量分別為0.15、0.33 mg/g，其峰面積的RSD分別為1.2%、1.1%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次（批號：201301202）已知含量的續(xù)骨沖和膏1 g（約含大黃素0.15 mg、大黃酚0.33 mg），共6份，分別置于磨口錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測定 精密稱取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab 2 Results of content determination（mg/g，n＝3）

3 討論

本制劑中各藥味的TLC鑒別試驗基本參照2010年版《中國藥典》（一部）中有關藥味的鑒別方法。其中，大黃、赤芍、當歸的TLC鑒別試驗方法分別與2010年版《中國藥典》方法基本一致。黃柏原采用2010年版《中國藥典》中的鑒別條件，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4，V/V/V）的下層溶液為展開劑[2]，結果斑點不清晰；后嘗試采用文獻方法[3]的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，結果斑點清晰，分離度好。木香原采用2010年版《中國藥典》中的鑒別條件，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑[2]，結果展開效果也很差，后參考文獻方法[4]改成三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇為展開劑，且經不斷調整各試劑比例，直至調整到5∶3∶0.1（V/V/V）時，其展開效果好。由于本制劑是由20味中藥組成的復方制劑，成分較為復雜，TLC鑒別過程中對提取方法及展開劑的選擇有較高要求，在對處方中骨碎補、續(xù)斷、防風、紅花、蒲黃、獨活等其余藥味的TLC鑒別研究中，存在圖譜斑點不清晰、拖尾、陰性干擾大等缺陷，需進一步研究，暫不列入標準中。

采用HPLC法測定大黃素和大黃酚含量時，供試品溶液的制備方法則參照了有關文獻方法，簡化了2010年版《中國藥典》中大黃含量測定項[2]中配制8%鹽酸溶液的步驟，縮短了回流提取時間。參照2010年版《中國藥典》（一部）中大黃含量測定項下的色譜條件，以甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25、80∶20、85∶15，V/V）多種比例試驗選擇流動相，當比例為85∶15時，大黃素和大黃酚的色譜峰分離度適合、基線平直、峰形對稱、其余成分無干擾。

綜上所述，本研究所建立的方法方便快捷，重現(xiàn)性、專屬性好，結果穩(wěn)定可靠，可作為續(xù)骨沖和膏的質量控制方法。

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