HPLC法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿片的含量及含量均勻度

高 微，邵海云，張吉娟，李鳳華，王宗立，黃雨蒙，王萌萌，王超眾（.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 6005；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江齊齊哈爾 6006）

氫溴酸山莨菪堿為莨菪生物堿類M膽堿受體拮抗藥，臨床應(yīng)用較為廣泛[1]。對(duì)于其含量測(cè)定方法，2010年版《中國(guó)藥典》（二部）采用紫外-可見分光光度（UV）法[2]，也有文獻(xiàn)采用線性滴定微機(jī)計(jì)算法[3]、一階導(dǎo)數(shù)分光光度法[4]和電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法[5]。為研究更為簡(jiǎn)單便捷的含量測(cè)定方法，本研究嘗試采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿片的含量，并測(cè)定其含量均勻度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，配有e2998型二極管陣列檢測(cè)器和Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；SHIMADZU UV-2550型UV計(jì)。

1.2 藥品與試劑

氫溴酸山莨菪堿片（安徽宏昌制藥廠，規(guī)格：5 mg，批號(hào)：20130901、20130902、20130903）；氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100051-201105）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFire C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%庚烷磺酸鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）（40∶60，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品適量，加水使溶解，制成每1 ml中約含1 mg氫溴酸山莨菪堿的溶液，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液適量，加水溶解并稀釋成每1 ml約含0.02 mg氫溴酸山莨菪堿的溶液，搖勻，濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取氫溴酸山莨菪堿片20片，精密稱定，研細(xì)，精密量取適量（約相當(dāng)于氫溴酸山莨菪堿10 mg），加水稀釋成每1 ml中約含0.02 mg的溶液，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液A（供含量測(cè)定用）。取本品1片，置于250 ml量瓶中，加水適量，充分震搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液B（供含量均勻度測(cè)定用）。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例和工藝制備缺氫溴酸山莨菪堿的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A的制備方法制得陰性空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在此條件下，陰性對(duì)照無(wú)干擾；理論板數(shù)按氫溴酸山莨菪堿峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.氫溴酸山莨菪堿Fig 1 HPLC chromatogramA.control sample；B.test sample；C.negative control；1.anisodamine hydrobromide

2.4 線性關(guān)系與定量限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液適量，分別置于100 ml量瓶中，加水稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、50、100 μg/ml的系列對(duì)照品溶液。分別精密量取系列對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝3 064.8x－646.12（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，氫溴酸山莨菪堿的質(zhì)量濃度在2.5～100 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。以信噪比為10計(jì)算，測(cè)得氫溴酸山莨菪堿的定量限為10 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

取氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.22%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品，共6份，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液A，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，樣品占標(biāo)示量的百分含量為98.26%，RSD＝0.43%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A適量，于配制0、1、2、4、6 h時(shí)分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.39%（n＝5），表明供試品溶液A在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品各適量，共9份，每3份為一組，分別加入適量氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品貯備液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液A，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量及含量均勻度測(cè)定

取3批氫溴酸山莨菪堿片樣品（批號(hào)：20130901、20130902、20130903）粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液A，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。取氫溴酸山莨菪堿樣品10片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液B，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，判定樣品的含量均勻度是否符合規(guī)定。結(jié)果，3批樣品占標(biāo)示量的百分含量分別為98.26%、98.75%、98.86%，含量均勻度分別為2.82、2.33、2.22。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為200～300 nm，結(jié)果供試品溶液在256 nm處有最大吸收，并在200～240 nm處有較強(qiáng)的末端吸收。雖然在兩個(gè)波長(zhǎng)處均可以得到較好的峰形，但200～240 nm處檢測(cè)到的雜質(zhì)峰較多且基線噪音較大；而256 nm為氫溴酸山莨菪堿的特征吸收峰，專屬性更強(qiáng)，因此本研究將檢測(cè)波長(zhǎng)選為256 nm。

3.2 色譜柱、流動(dòng)相的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中，筆者曾考察了C18、C8等色譜柱，甲醇-磷酸鹽緩沖液，離子對(duì)色譜等色譜條件。結(jié)果表明，在采用乙腈-0.1%庚烷磺酸鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5，40∶60，V/V）為流動(dòng)相、C8色譜柱的色譜條件時(shí)，氫溴酸山莨菪堿的色譜峰形最佳、重復(fù)性最好。

本研究建立了HPLC法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿片含量的方法，而2010年版《中國(guó)藥典》（二部）中收載的方法為UV法。筆者曾對(duì)兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明UV法提取過(guò)程較為煩瑣，消耗時(shí)間較長(zhǎng)，且結(jié)果重復(fù)性較差；而HPLC法則更為簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，且重復(fù)性更好、專屬性更高，更適合該樣品的含量測(cè)定?！吨袊?guó)藥典》附錄中規(guī)定：片劑每片標(biāo)示量不大于10 mg者，均應(yīng)檢查含量均勻度[6]，因此有必要將含量均勻度檢查列入氫溴酸山莨菪堿片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之中。

[1]陳桃生.氫溴酸山莨菪堿的臨床新應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2000，12（supple）：30.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：556、附錄ⅩE88.

[3]曹共民，高慶一，尹光華，等.線性滴定微機(jī)計(jì)算法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿含量的初步研究[J].華西藥學(xué)雜志，1989，4（1）：37.

[4]李德明，范義鳳，王華.一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿凝膠中氫溴酸山莨菪堿的含量[J].中國(guó)交通醫(yī)學(xué)雜志，2005，19（1）：83.

[5]王偉，孫為德.電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法間接測(cè)定氫溴酸山莨菪堿注射液[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34（4）：183.