亞麻木酚素緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉效栓，畢映燕，李季文，吳曉琴，錢夢茹（甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，蘭州 730050）

亞麻木酚素是一種與人體雌激素十分相似的植物雌激素?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，亞麻木酚素具有抗氧化、延緩衰老[1]、抗腫瘤[2]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[3]、降低血清膽固醇[4]、免疫調(diào)節(jié)等功效，尤其在減輕婦女絕經(jīng)期癥狀、預(yù)防乳癌和前列腺癌等方面具有良好的療效[5]，且其在預(yù)防糖尿病方面也發(fā)揮著重要作用[6]。目前，國內(nèi)外對亞麻木酚素的研究多集中在提取、分離、純化、藥理等方面[7]，關(guān)于亞麻木酚素類藥物制劑的研究則未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以亞麻木酚素緩釋片為研究對象，采用高效液相色譜（HPLC）法測定其中亞麻木酚素的含量，并對其體外釋放度進(jìn)行研究，以為建立亞麻木酚素緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、有效控制制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC儀，包括1525型泵、717型進(jìn)樣器、2487型雙通道紫外檢測器（美國Waters公司）；HS 3120型超聲波清洗儀（寧波新基生物科技股份有限公司）；BS2245型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；RZQ-8D型自動溶出取樣收集系統(tǒng)（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

亞麻木酚素緩釋片（甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號：20130306、20130309、20130312）；亞麻木酚素對照品（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號：MUST-12030303，純度≥98%）；甲醇（天津百世化工有限公司，分析純；天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司，色譜純）；磷酸二氫鉀（上海國藥集團(tuán)，分析純）；氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；鹽酸（天津百世化工有限公司，分析純）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 含量測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry Shield-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：282 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μl。在此色譜條件下，樣品中被測成分能夠達(dá)到基線分離，相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)以亞麻木酚素峰計(jì)應(yīng)大于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取亞麻木酚素對照品9.0 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2.2 供試品溶液 取亞麻木酚素緩釋片10片，研細(xì)，過4號篩，精密稱取0.2 g，置于100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：300 W，頻率：25 kHz）處理15 min，放涼，加甲醇稀釋至刻度，濾過；取續(xù)濾液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按亞麻木酚素緩釋片的處方工藝，精密稱取各輔料適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，樣品中的輔料成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.亞麻木酚素Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative sample；1.secoisolariciresinol diglucoside

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的亞麻木酚素對照品溶液適量，加甲醇制成每1 ml含亞麻木酚素0.018、0.045、0.090、0.135、0.180、0.225 mg的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、亞麻木酚素的質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝5×106x+21 041（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，亞麻木酚素的質(zhì)量濃度在0.018～0.225 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的亞麻木酚素對照品溶液10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號：20130309）10μl，分別于配制0、4、8、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.99%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批亞麻木酚素緩釋片（批號：20130309）粉末各適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.63%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（150.8 mg/g）的亞麻木酚素緩釋片粉末適量，共6份，分別精密加入亞麻木酚素對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取亞麻木酚素緩釋片粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 體外釋放度測定方法與結(jié)果

照2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅩC溶出度測定法中的轉(zhuǎn)籃法進(jìn)行。取亞麻木酚素緩釋片（批號：20130309）6片，分別置于900 ml蒸餾水中，設(shè)定轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度（37±0.5）℃，在不同取樣時(shí)間點(diǎn)分別取樣5 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過（從取樣至濾過應(yīng)在30 s內(nèi)完成），同時(shí)補(bǔ)充5 ml相同溫度、相同體積的水。精密吸取濾液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中的藥物濃度及每片藥物不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度，結(jié)果見表3。

表3 亞麻木酚素緩釋片不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度（n＝6）Tab 3 Results of accumulative releasing ratio at different time points（n＝6）

根據(jù)2010年版《中國藥典》（二部）緩控釋制劑指導(dǎo)原則關(guān)于取樣時(shí)間點(diǎn)的規(guī)定（第1點(diǎn)的累積釋放度約30%，第2點(diǎn)約為50%，最后取樣點(diǎn)約為75%），選擇取樣時(shí)間點(diǎn)為2、6、12 h進(jìn)行累積釋放度測定。結(jié)果，本品每片在2、6、12 h時(shí)的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%，均符合規(guī)定。

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

目前，亞麻木酚素的HPLC法測定多使用梯度洗脫系統(tǒng)[8-9]。筆者曾嘗試了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸、乙腈-酸等流動相梯度、等度洗脫系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙腈等度系統(tǒng)均能將亞麻木酚素與相鄰雜質(zhì)峰完全分離，但由于乙腈揮發(fā)性較甲醇強(qiáng)，毒性較大，故最后選擇甲醇-水等度洗脫作為流動相系統(tǒng)。

4.2 溶出介質(zhì)的選擇

按照釋放度測定法[10]，筆者考察了水、磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）、鹽酸溶液（0.1 mol/L）對亞麻木酚素釋放度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種溶出介質(zhì)對亞麻木酚素的累積釋放度無顯著影響，故選擇水作為溶出介質(zhì)。

4.3 體外釋放度測定方法的選擇

亞麻木酚素緩釋片的凝膠骨架材料易吸水膨脹并產(chǎn)生較大的黏性，易粘于杯底，故采用轉(zhuǎn)籃法進(jìn)行測定。

4.4 檢測波長和輔料干擾試驗(yàn)

分別取緩釋片樣品粉末及其輔料各適量，溶于蒸餾水中，分別在190～390 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，樣品在282 nm波長處有最大吸收，而輔料無吸收，表明輔料對測定無干擾，故最終選擇282 nm作為檢測波長。

綜上所述，該方法準(zhǔn)確、簡便，專屬性、重復(fù)性好，可用于亞麻木酚素緩釋片的質(zhì)量控制。

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