毛姍姍 沈玨 邱蕓香
圍生期甲狀腺功能減退對新生仔鼠心肌細(xì)胞自噬的影響
毛姍姍 沈玨 邱蕓香
目的 探討心肌細(xì)胞自噬在仔鼠圍生期甲狀腺功能減退(簡稱甲減)致心功能損害中的作用,并觀察左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療后自噬指標(biāo)的改變。方法 SD孕鼠自孕15d起每日予丙基硫氧嘧啶(PTU)50mg/d灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個哺乳期,制成圍生期甲減模型,出生仔鼠為甲減組,其余孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃,出生仔鼠為對照組,部分甲減仔鼠自出生當(dāng)日起予以每日腹腔注射L-T4 2μg/100g,為治療組,收集甲減組、治療組及對照組(每組8只)出生7d齡仔鼠的心室肌組織,采用Western b lot法測定并比較心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達(dá),同時測定并比較血清甲狀腺激素水平及CK-MB、LDH與AST水平。結(jié)果 甲減組仔鼠CK-MB、LDH及AST水平均高于對照組(均P<0.01),治療組仔鼠3者水平均較甲減組下降(均P<0.01);甲減組仔鼠LC3II/LC3I及cathepsin D表達(dá)水平均高于對照組(均P<0.01),治療組仔鼠2者的表達(dá)水平均較甲減組降低(均P<0.01)。結(jié)論 心肌細(xì)胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)新生仔鼠心功能損害中起重要作用。
甲狀腺功能減退癥 自噬 微管相關(guān)蛋白LC3 新生大鼠
圍生期甲狀腺激素水平對小兒多個器官的發(fā)育、代謝和功能調(diào)控起著重要作用,近年來有關(guān)先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism,CH)對兒童心血管系統(tǒng)的影響逐漸受到關(guān)注,我們前期的研究已證實(shí)CH新生兒可出現(xiàn)心臟收縮、舒張功能損害,通過早期左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療可逆轉(zhuǎn)受損心功能[1-2]。
自噬性程序性細(xì)胞死亡(簡稱自噬)是指細(xì)胞在胞內(nèi)通過溶酶體降解途徑消化其自身成分的過程。近年來越來越多的報道證實(shí),自噬參與了多種原因?qū)е滦墓δ軗p害的過程[3-4]。我們前期的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圍生期甲狀腺功能減退(簡稱甲減)可通過改變心肌肌漿網(wǎng)相關(guān)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Ca2+-ATP酶(SERCA2a)與磷酸受納蛋白(PLB)等基因轉(zhuǎn)錄,以調(diào)控新生仔鼠心功能損害的相關(guān)機(jī)制[5]。目前圍生期甲減致心功能損害的具體方式未知,心肌細(xì)胞自噬是否參與該過程尚待進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立圍生期甲減及甲狀腺素替代治療新生仔鼠模型,測定自噬相關(guān)蛋白如微管相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達(dá),旨在探討心肌細(xì)胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)心功能損害中的作用以及甲狀腺素替代治療的反應(yīng),現(xiàn)報道如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑 清潔級SD懷孕大鼠15只,由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,體重295~ 342g,喂飼普通飼料,自由飲水和進(jìn)食,自然節(jié)律采光。丙基硫氧嘧啶(PTU)由南通精華制藥有限公司生產(chǎn);L-T4由美國Sigma公司生產(chǎn);游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)試劑盒由美國DPC公司生產(chǎn),CK-MB、LDH和AST試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn);自噬相關(guān)蛋白兔抗鼠LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ多克隆抗體由美國Abcam公司生產(chǎn),兔抗鼠cathepsin D單克隆抗體由美國Abcam公司生產(chǎn),二抗由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)。
1.2 方法
1.2.1 動物模型的制備和分組[6]11只SD孕鼠自孕15d起每日予以PTU(50mg/d)灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個哺乳期,出生仔鼠51只為甲減仔鼠,采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取27只為甲減組;余24只自出生當(dāng)日起每日腹腔注射L-T4 2μg/100g,為治療組。另4只孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃,出生仔鼠21只為對照組。甲減組仔鼠及對照組仔鼠同時予以腹腔注射假手術(shù)。飼養(yǎng)7d后每組取8只,稱體重后斷頭處死,并立即開胸取出心臟置于冰0.9%氯化鈉溶液中,剪去心房、腱索及脂肪組織,并洗凈血液,濾紙吸干水分,稱心室凈重后立即放至液氮中凍存。
1.2.2 血清甲狀腺激素、心肌酶譜水平測定 分離各組仔鼠血清,采用天津德普(生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒測定血清FT3、FT4和TSH水平。分離各組仔鼠血清,全自動生化分析儀及配套試劑盒測定血清CKMB、LDH和AST水平。
1.2.3 自噬相關(guān)蛋白的檢測 采用Western blot法檢測心肌組織LC3與cathepsin D的表達(dá)。取仔鼠心肌組織,4℃冰上組織勻漿裂解后,14 000r/min離心5 min,取上清液后提取大鼠心肌總蛋白,采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDSPAGE膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、以1∶1 000加入一抗孵育、4℃過夜,經(jīng)TBST漂洗后37℃二抗孵育1h,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像,用NIH Scion Image軟件分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin之比值的相對灰度值,以表示蛋白的相對表達(dá)水平。LC3的表達(dá)水平用LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)表示。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。
2.1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較 見表1。
表1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較
由表1可見,甲減組血清FT4水平接近藥盒檢測底限(2.8pmol/L),低于對照組(P<0.01),血清FT3水平較對照組降低(P<0.01),血清TSH水平較對照組升高(P<0.01);治療組血清FT4、FT3水平均較甲減組升高(均P<0.01),而血清TSH水平下降(P<0.01);治療組與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。
2.2 各組仔鼠血清心肌酶譜水平的比較 見表2。
表2 各組仔鼠心肌酶譜水平的比較(U/L)
由表2可見,甲減組血清CK-MB、LDH及AST水平均高于對照組(均P<0.05);治療組心肌酶譜水平均低于甲減組(均P<0.05);治療組與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。
2.3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較 見表3。
表3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較(灰度值)
由表3可見,甲減組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D均高于對照組(均P<0.01),治療組仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D較甲減組均降低(均P<0.01),與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。
CH是兒科較常見的一種內(nèi)分泌疾病,由于其圍生期甲狀腺激素減少,可對出生患兒的生長和智力發(fā)育造成嚴(yán)重影響[7]。圍生期甲減是由胎兒甲狀腺發(fā)育不良或者孕母甲狀腺激素缺乏引起,出生患兒即表現(xiàn)為CH。本研究通過孕鼠服用抗甲狀腺激素藥物PTU制備圍生期甲減動物模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲減組仔鼠血清FT3、FT4下降,TSH升高,同時部分出生甲減仔鼠予以L-T4治療,治療后仔鼠血清甲狀腺激素水平顯著上升,替代治療對恢復(fù)甲狀腺功能有顯著效果,提示模型制備成功。
心臟是甲狀腺激素作用的主要靶器官之一,CH患兒在新生兒期即可出現(xiàn)心臟收縮和舒張功能損傷,早期給予甲狀腺素替代治療后受損心功能可得到逆轉(zhuǎn)[1]。本研究結(jié)果顯示,甲減組新生仔鼠心肌酶譜CK-MB、LDH及AST水平均較對照組顯著升高,經(jīng)早期L-T4治療后可降至接近正常水平,從而進(jìn)一步證實(shí)圍生期甲減所致心功能損害以及早期甲狀腺素的有效替代治療作用。我們之前的研究表明,CH引起以上心功能改變的機(jī)制可能與相關(guān)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載相關(guān)[5],然而最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡的方式尚有待探究。
心肌細(xì)胞的功能有賴于在復(fù)雜的調(diào)控下達(dá)到內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,自噬作為細(xì)胞死亡的其中一種調(diào)控方式,在維持心肌細(xì)胞新陳代謝中起到重要作用。自噬又稱自體吞噬,當(dāng)機(jī)體處在病理?xiàng)l件下,如鈣超載、缺血缺氧等,細(xì)胞可啟動自噬以清除受損的線粒體,保證正常細(xì)胞的存活,并分解細(xì)胞器獲得補(bǔ)充能量。然而,大量自噬仍可導(dǎo)致過多的細(xì)胞自我消化,造成不可逆的細(xì)胞損害與細(xì)胞死亡。微管相關(guān)蛋白LC3是參與自噬小體膜形成的泛素樣調(diào)節(jié)蛋白,同時也是是哺乳動物細(xì)胞中自噬發(fā)生的重要標(biāo)記物。LC3蛋白分為Ⅰ型游離型和Ⅱ型膜結(jié)合型,自噬發(fā)生時,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)化,因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ常作為定量分析自噬的重要指標(biāo)。另一個自噬相關(guān)蛋白cathepsin D,也常作為評價細(xì)胞自噬激活的程度[8]。cathepsin D是一種水解酶,在溶酶體中降解損壞的蛋白質(zhì),參與細(xì)胞自噬的過程。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)圍生期甲減新生仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及cathepsin D的表達(dá)均顯著增強(qiáng),說明心肌細(xì)胞自噬參與圍生期甲狀腺激素減少致心功能損傷過程。經(jīng)LT4早期替代治療后,兩者表達(dá)均顯著下降,提示甲狀腺素替代治療可通過增加甲狀腺功能,調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平,減輕心肌損傷,從而最終改善心功能。結(jié)合我們的前期研究,我們推測圍生期甲減可下調(diào)心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性,造成鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載,從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬發(fā)生。這一系列調(diào)控改變可能為CH引起新生兒心臟收縮和舒張功能損害的提供重要分子機(jī)制研究。目前,調(diào)節(jié)該過程的具體分子機(jī)制或信號通路尚不清楚,仍需進(jìn)一步探索,這將是我們下一步研究的方向,為圍生期甲減性致心臟損害的病理生理學(xué)研究及其預(yù)防、治療方法的改進(jìn)提供新的思路。
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Alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats
MAO Shanshan,SHEN Jue,QIU Yunxiang.Department of Pediatrics,the Children's Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China
Hypothyroidism Autophagy Microtubule-associated p rotein LC3 Neonatalrat
2014-12-25)
(本文編輯:馬雯娜)
浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201019211);浙江省人口計(jì)劃生育科研項(xiàng)目(201493583)
310003杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒內(nèi)科
毛姍姍,E-mail:maoshanshan33@163.com
【 Abstract】 Objective To investigate the alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats. Methods Hypothyroidism was induced by gavage of propylthiouracil(PTU,50mg/d)solution from embryonic d15 through the lactational period in pregnant SD rats.The offspring of hypothyroid rats was divided into two groups:in L-T4 treatment group(n=8)the neonatal rats received intraperitoneal injection of levothroxine(L-T4,2μg/100g.d)starting from the day of birth;in hypothyroid group(n=8)the neonatalrats received normal saline instead of L-T4.The offspring of normal pregnant rats served as control group (n=8).Animals were sacrificed at postnatal d 7.Serum thyroid hormone levels and myocadial enzymes CK-MB,LDH and AST were measured;LC3I,LC3II and cathepsin D protein levels were detected by Western blotting. Results Hypothyroid neonatal rats had significant higher myocardial CK-MB,LDH and AST levels than those in control group(P<0.01),while those indicators were significantly decreased in L-T4 treatment group compared to hypothyroid group.Compared with control group,LC3I,LC3IIand cathepsin D p rotein levels were significantly higher(P<0.01)in neonatalhypothyroid group(P<0.01),while L-T4 treatmentg roup showed a significant decrease compared w ith hypothyroid group(P<0.01). Conclusion Cardiomyocyte autophagy may be involved in the pathogenesis ofmyocardialsystolic and diastolic dysfunc tion in hypothyroidism neonatal rats.