板藍(lán)根糖肽的組成測定

胡 坪， 陳 燁， 楊子峰， 高云霄， 張 敏， 章弘揚， 王月榮*

(1. 上海市功能性材料化學(xué)重點實驗室，華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237;2. 澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中國澳門;3. 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，呼吸疾病國家重點實驗室，廣東 廣州510230;4. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237)

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort. 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有清熱解毒、涼血利咽功能。臨床上常用于病毒性疾病及細(xì)菌性感染疾病，但其抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不十分明確［1］。板藍(lán)根常以水溶性部分入藥，多糖是水溶性部分的主要成分，占板藍(lán)根藥材生藥量的9.38% ～22.09%［2］，被認(rèn)為是板藍(lán)根抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［3］。亦有文獻(xiàn)報道，板藍(lán)根抗病毒的活性成分可能為糖肽與蛋白或多肽的復(fù)合物［4］，即糖蛋白或糖肽。目前，針對板藍(lán)根多糖結(jié)構(gòu)的研究較多，而關(guān)于其糖蛋白或糖肽的相關(guān)研究則鮮有報道。

本實驗從板藍(lán)根中分離得到均一糖肽，重點研究該糖肽的氨基酸組成和單糖組成。以響應(yīng)面曲線法優(yōu)化糖肽中氨基酸水解條件，柱前在線衍生高效液相色譜法［5-6］測定氨基酸組成，并利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化法測定其單糖組成，為闡明板藍(lán)根糖肽的一級結(jié)構(gòu)及其抗病毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

Agilent 1100 高效液相色譜儀(Agilent 公司，美國)配備DAD 檢測器和Alltech 3300 ELSD 檢測器(上海埃紋斯科貿(mào)有限公司);RE-52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器有限公司);UV-2550紫外可見分光光度計(SHIMADZU Corporation，Japan);FD1 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康儀器有限公司);CH-8606 微量分析天平(瑞士梅特勒托利多公司);D100 B 蠕動泵(上海青浦滬西儀器廠);BSZ-100 自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠);40 Hz 300 W 數(shù)控功率可調(diào)加熱超聲波清洗機(jī)(上海聲彥超聲波儀器有限公司);EPED-E2-10TF 超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司);TSK G3000PW 凝膠色譜柱 (日本TOSOH 公司);Eclipse XDB-C18柱 (美國Agilent 公司);Inertsil ODS-SP 柱(日本Shimadzu-GL 公司)。

板藍(lán)根(產(chǎn)自廣州白云山和記黃埔中藥有限公司GAP 基地，安徽阜陽);硫酸(分析純，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司);石油醚(沸程60 ～90 ℃)，苯酚(分析純，上海試劑一廠);DEAE-瓊脂糖 (GE Healthcare);Sephacryl-200 (GE，Sweden)，乙腈(色譜純，Honeywell);無水乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三氟乙酸(CP，上海凌峰化學(xué)有限公司);硼砂(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);3-巰基丙酸(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，純度98%);葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、D-果糖(上海源聚生物科技有限公司，純度99%);D-葡萄糖醛酸(Johnson 公司，純度98%);標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-1(Mw=1 000)、T-2 (Mw=5 000)、T-3 (Mw =12 000)、T-4 (Mw =50 000)(瑞士Fluka 公司);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮PMP (阿拉丁試劑，99%);17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液包(含15 種一級氨基酸和2 種二級氨基酸，Sigma 公司);鄰苯二甲醛OPA (Sigma 公司，色譜純，純度≥99%)、9-芴甲基氯甲酸酯FMOC (Sigma 公司，色譜純，純度≥99%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根糖肽的提取和分離純化 板藍(lán)根糖肽的提取、分離、純化步驟參考文獻(xiàn)［7-8］。取板藍(lán)根藥材粉末約500 g，用4 倍石油醚進(jìn)行回流脫脂1 h，藥渣室溫?fù)]干后，用10 倍量去離子水回流提取2 h，冷卻，離心，傾出上清液。藥渣再用10 倍量去離子水回流提取2 h，冷卻后，離心。合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至藥液比1 ∶3 ～1 ∶4。加入一定量的無水乙醇，使提取液含醇量達(dá)50%，靜置過夜，離心，棄去沉淀。上清液繼續(xù)加入無水乙醇至含醇量達(dá)70%，靜置過夜，離心。沉淀冷凍干燥，得板藍(lán)根粗多糖。取適量板藍(lán)根粗多糖，溶解，加入等體積的10% 三氯乙酸溶液，振搖、離心除去沉淀，如此往復(fù)，直至再無沉淀析出，即得脫蛋白板藍(lán)根粗提物。

取適量板藍(lán)根粗提物用去離子水溶解，依次用DEAE-fast flow 柱、Sephacryl-200 柱層析分離，水洗脫，苯酚-硫酸法［9］和紫外分光光度法同時檢測，合并峰位，冷凍干燥，得到一精制板藍(lán)根糖肽ISP。

2.2 板藍(lán)根糖肽純度及分子質(zhì)量測定 采用GPCELSD 法測定板藍(lán)根糖肽ISP 的純度及分子質(zhì)量分布［10］。色譜條件為TSKG3000 凝膠色譜柱;流動相為5 mmol/L 甲酸銨水溶液，體積流量為0.8 mL/min，進(jìn)樣10 μL;ELSD 檢測器漂移管溫度85 ℃，氣體流量1.6 L/min。

取不同分子質(zhì)量的葡聚糖對照品(Mw 分別為1 000，5 000，12 000，25 000，50 000，150 000)配制成質(zhì)量濃度約為10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，由標(biāo)準(zhǔn)多糖的分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間求得回歸方程為lg(Mw)=9.012 7 -0.532 4t，相關(guān)系數(shù)r=0.998。

取10 mg 板藍(lán)根糖肽樣品溶于1 mL 純水中，按上述色譜條件進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根糖肽經(jīng)凝膠色譜分離后得到一個單一對稱色譜峰，表明該樣品是均一的［11］;該色譜峰在210 nm、280 nm 處均有紫外吸收，且ISP 苯酚硫酸法顯色明顯，推測板藍(lán)根糖肽是與肽鏈結(jié)合的均一糖肽。根據(jù)板藍(lán)根糖肽在凝膠色譜中的保留時間，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出其重均分子質(zhì)量(Mw)約為21 000。

2.3 板藍(lán)根糖肽的單糖組成分析［12］

2.3.1 糖肽中糖鏈的水解 稱取板藍(lán)根糖肽3.91 mg 于5 mL 安瓿瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸(TFA)，封管，110 ℃烘箱中加熱水解2 h，冷卻至室溫，溶液于40 ℃減壓濃縮至干，加甲醇1.5 mL 減壓蒸干，如此重復(fù)操作4 ～5 次，以除盡TFA，并濃縮至干。

2.3.2 PMP 柱前衍生化分析 取1 mL 的單糖混合對照品溶液(葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖質(zhì)量濃度均為0.400 mg/mL)，加入1 mL 的0.6 mol/L NaOH 溶液，置于10 mL 的具塞試管中混合均勻;加入1 mL的0.5 mol/L PMP 甲醇溶液，混勻后，置于70 ℃烘箱中加熱反應(yīng)30 min，取出，室溫放置10 min;再加入1 mL 鹽酸溶液(0.3 mol/L)中和。加3 mL 三氯甲烷，振搖，靜置，棄去三氯甲烷相，萃取3 次。水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供HPLC 進(jìn)樣分析。

將已用TFA 酸水解處理的ISP 樣品，用1.3 mL 超純水溶解，取1 mL 于10 mL 試管中，按標(biāo)樣的方法進(jìn)行衍生化和測定。

HPLC 色譜條件為:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L 磷酸二氫鈉和0.1 mol/L 磷酸氫二鈉體積比43.5 ∶ 56.5，pH6.7)-乙腈(體積比為85 ∶15);柱溫30 ℃;檢測波長250 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL。

2.3.3 板藍(lán)根糖肽的單糖組成分析結(jié)果 板藍(lán)根糖肽水解產(chǎn)物PMP 衍生色譜圖如圖1 (B)所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的PMP 衍生色譜圖(圖1A)對照，可確定板藍(lán)根糖肽中含有葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖。通過單點校正法可得板藍(lán)根糖肽的單糖組成為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶ 阿拉伯糖= 132.6 ∶ 5.0 ∶ 1.0 ∶7.6 ∶7.0∶23.8 ∶76.8，糖肽中糖的總質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為94.5%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物 (A)和板藍(lán)根糖肽水解產(chǎn)物(B)的PMP 衍生色譜圖Fig.1 PMP derivative HPLC chromatograms of standard mixture of monosaccharide (A)and hydrolysis product of glycopeptide of Radix Isatidis (B)

2.4 板藍(lán)根糖肽的氨基酸組成分析

2.4.1 糖肽中肽鏈酸水解條件的響應(yīng)面試驗設(shè)計

影響糖肽中肽鏈水解程度的因素有很多，為了全面考察各個因素的影響以及因素之間的相互影響，本實驗選取響應(yīng)面分析(RSA)法對肽鏈的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，應(yīng)先通過單因素試驗來選取因素和水平。影響糖肽水解的主要因素有酸濃度、水解時間、水解溫度等。本試驗以鹽酸作為水解酸，濃度選取1、3、6、9 mol/L 四個水平;水解時間選取12、24、60、72、84 h 五個水平;水解溫度選取100、110、120、150 ℃四個水平，以糖肽水解液(5.57 mg/mL)中蘇氨酸的峰面積為評價指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken 中心組合設(shè)計，選取酸濃度、水解時間、水解溫度為因素，每個因素取3 個水平。以(-1，0，1)編碼，各編碼值如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Tab.1 Factors level table of response surface analysis

2.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果 根據(jù)表1 設(shè)計了三因素三水平共17 個試驗點的響應(yīng)面分析試驗。實驗方案與結(jié)果見表2。其中12 個為析因試驗，5 個為中心試驗。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到水解時間、酸濃度、水解溫度與蘇氨酸峰面積之間的二次多項回歸方程。A=1 263.478 19 +29.277 73X1-0.472 69X2+8.234 33X3- 0.845 31X1X2- 0.053 813X1X3-0.340 75X2X3-0.442 43X+7.104 23X-0.018 798X

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Tab.2 Scheme and results of response surface analysis

對上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis results of the response surface analysis

表3 表明，一次項中酸濃度及水解時間對蘇氨酸峰面積的線性效應(yīng)顯著;二次項中酸濃度對蘇氨酸的曲面效應(yīng)極顯著，水解時間對蘇氨酸的曲面效應(yīng)顯著;各因子間交互作用不顯著。在本實驗設(shè)計范圍內(nèi)回歸方程顯著性檢測P ＜0.000 1，模型的確定系數(shù)為0.976 6，說明該模型能解釋97.66%的響應(yīng)值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，試驗誤差較小，證明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化的糖肽的肽鏈水解條件是可行的。

圖2 ～圖4 是蘇氨酸峰面積的三維響應(yīng)面曲線和等高圖。可以看出，當(dāng)水解溫度和水解時間都固定時，蘇氨酸峰面積隨酸濃度的變化幅度最大，而隨水解溫度和水解時間的變化幅度相對較小。所以，酸濃度對蘇氨酸峰面積的影響較為顯著。通過最優(yōu)化分析，最佳水解條件為水解時間為17 h，水解溫度為104 ℃，酸濃度應(yīng)盡可能的大，但考慮到操作的可行性，酸濃度取10 mol/L。

圖2 水解時間固定在0 水平，Y = (A，B)響應(yīng)面和等高圖Fig.2 Hydrolysis time fixed at level 0，Y= (A，B)of the response surface and contour map

圖3 水解時間固定在0 水平，Y = (A，C)響應(yīng)面和等高圖Fig.3 Hydrolysis time fixed at level 0 ，Y = (A，C)of the response surface and contour map

圖4 水解時間固定在0 水平，Y= (B，C)響應(yīng)面和等高圖Fig.4 Hydrolysis time fixed at level 0，Y = (B，C)of the response surface and contour map

2.4.3 氨基酸的在線柱前衍生化分析方法 色譜條件為:Inertsil ODS-SP 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相A 為40 mmol/L Na2HPO4，用NaOH溶液調(diào)pH 至7.8，流動相B 為ACN-MeOH-水(45 ∶45 ∶10)，梯度洗脫(0.0 ～1.9 min，2.0%B;1.9 ～18.1 min，1.9% ～57% B;18.1 ～18.6 min，57% ～100.0% B;18.6 ～22.30 min，100%B);體積流量1.0 mL/min;柱溫40 ℃;檢測器UV 338 nm、262 nm。

鄰苯二甲醛(OPA)溶液的配制:10 mg OPA溶于1 mL 溶液(0.16 mL 甲醇+0.14 mL 硼酸緩沖液+0.69 mL 純水+0.01 mL 3-巰基丙酸)。硼酸緩沖液的配制:0.1 mol/L，用0.4 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至10。9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)溶液的配制:10 mg FMOC 溶于1 mL 乙腈。

氨基酸的柱前在線衍生化在高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器的定量環(huán)中進(jìn)行。自動衍生程序為［13］:抽取硼酸鹽緩沖液2.5 μL;抽取樣品1.0 μL;混合5 次;等待0.20 min;抽取OPA 溶液1.0 μL;混合10 次;抽取FMOC 溶液1.0 μL，抽取純水32 μL，等待0.3 min 進(jìn)樣。

2.4.4 板藍(lán)根糖肽的氨基酸組成分析 吸取17 種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為2.5 μmol/mL)1 μL，按“2.4.3”項下柱前在線衍生化程序衍生并進(jìn)行HPLC 測定。

將ISP 配制成5.57 mg/mL 的水溶液，按照響應(yīng)面曲線的優(yōu)化條件對其進(jìn)行水解，取1 mL 水解液，氮吹至干，用100 μL 純水復(fù)溶，按“2.4.3”項的柱前在線衍生化程序衍生并進(jìn)行HPLC 測定。以單點校正法計算板藍(lán)根糖肽ISP 的氨基酸組成。

2.4.5 板藍(lán)根糖肽氨基酸組成分析結(jié)果 本實驗采用的氨基酸分析法將自動在線衍生化與HPLC 相結(jié)合，其中一級氨基酸用OPA 進(jìn)行衍生，二級氨基酸用FMOC 進(jìn)行衍生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根糖肽水解液中未檢測到二級氨基酸。將板藍(lán)根糖肽水解液OPA 衍生色譜圖(圖5B)與15 種一級氨基酸的OPA 衍生色譜圖(圖5A)比較，確定其氨基酸組成主要為蘇氨酸等12 種一級氨基酸。

將板藍(lán)根糖肽ISP 按最優(yōu)的水解條件進(jìn)行水解后進(jìn)行在線柱前衍生化HPLC 分析，以單點校正分別計算出每種氨基酸的含有量，結(jié)果列于表4 中。經(jīng)換算，板藍(lán)根糖肽ISP 中的肽鏈組成為(各氨基酸摩爾比)天門冬氨酸∶谷氨酸∶絲氨酸∶組氨酸∶蘇氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶纈氨酸∶苯丙氨酸∶異亮氨酸∶亮氨酸∶賴氨酸=3.8 ∶3.8 ∶2.5 ∶0.7 ∶2.5 ∶1.1 ∶2.9 ∶1.9 ∶0.6 ∶1.0 ∶1.5 ∶1.3，總氨基酸質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為5.4%。

圖5 15 種一級氨基酸標(biāo)樣(A)和精制板藍(lán)根糖肽水解產(chǎn)物(B)的OPA 衍生化產(chǎn)物色譜圖Fig.5 OPA derivatives products chromatograms of 15 kinds of amino acids standard solution (A)and ISP hydrolysis product (B)

表4 精制板藍(lán)根糖肽水解產(chǎn)物中12 種氨基酸的量(n=3)Tab.4 Contents of 12 kinds of amino acids in ISP hydrolysis product (n=3)

3 討論

3.1 本實驗采用水提醇沉法從板藍(lán)根藥材中提取板藍(lán)根粗多糖。經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，50%乙醇醇沉得到的粗多糖中大多是淀粉質(zhì)，溶解性極差，因此被棄去。70%乙醇醇沉得到的粗多糖分子質(zhì)量在幾千到幾萬之間，而再用90%的乙醇醇沉得到的糖分子質(zhì)量大多小于1000。因此，本實驗選取了具有較大研究價值的70%醇沉粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

3.2 PMP 柱前衍生化法反應(yīng)條件溫和，靈敏度高，且產(chǎn)物無異構(gòu)體，常用于測定多糖的單糖組成。然而，該方法并不能衍生化酮糖，因此，在進(jìn)行板藍(lán)根糖肽的單糖組成測定之前，還利用HPLCELSD 方法測定了板藍(lán)根糖肽水解液，結(jié)果表明，板藍(lán)根糖肽水解液中未見果糖色譜峰。由于HPLCELSD 法對單糖混合物的分離能力不及PMP 法，故本實驗選取PMP 衍生化HPLC 法測定板藍(lán)根糖肽的單糖組成。

3.3 糖肽的氨基酸組成分析包括糖肽中肽鏈的水解及氨基酸殘基的定性定量分析兩個步驟。響應(yīng)面分析法(RSA)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法，其中，Box-Behnken 的中心組設(shè)計是常見的RSA 法，適用多個因素的優(yōu)化試驗［14］。本研究采用RSA 優(yōu)化糖肽的水解條件，模型與實際實驗擬合良好，表明該方法適合用于糖肽水解條件的優(yōu)化。

3.4 本實驗分離得到一種板藍(lán)根均一糖肽。經(jīng)PMP 柱前衍生化HPLC 法測定，其糖鏈主要由甘露糖、阿拉伯糖等7 種單糖殘基組成，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為94.5%，表明該糖肽的糖成分較多。經(jīng)OPA柱前在線衍生化HPLC 法測定，板藍(lán)根糖肽的肽鏈主要由蘇氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸等12 種氨基酸殘基組成，其含有量為5.4%，表明該糖肽的肽成分較少。該糖肽組成的測定方法簡便快速，研究結(jié)果為闡明板藍(lán)根糖肽的一級結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

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