丹參作用于水通道蛋白AQP4 的活性成分虛擬篩選

陳少軍 ， 任紀(jì)龍

(1. 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥系，浙江寧波315000;2. 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理系神經(jīng)生理教研室，浙江杭州310000)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止疼、涼血消癰、除煩安神的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、保護(hù)心肌、抑制和解除血小板聚集、抑制膠原纖維的產(chǎn)生和促進(jìn)纖維蛋白的降解、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用［1］。臨床上丹參主要用于治療心腦血管疾病，是目前活血化瘀藥中使用最廣泛的一味中藥。

中醫(yī)認(rèn)為，氣血津液生理上同源互化，相互制約，病理上相互為害，一損俱損。丹參同樣也會(huì)對(duì)水液具有一定的調(diào)節(jié)作用。水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一類特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的蛋白，它的正常表達(dá)可能是運(yùn)化水濕、津液輸布的分子生物學(xué)基礎(chǔ)［2］。

因此，作為活血化瘀代表性藥物，丹參有可能作用于AQPs 蛋白，如采用傳統(tǒng)藥理學(xué)方法費(fèi)事費(fèi)力。本實(shí)驗(yàn)利用計(jì)算機(jī)手段探討丹參作用于AQP4 的活性成分虛擬篩選，并對(duì)其靶標(biāo)相互作用進(jìn)行模擬研究。

1 方法與材料

1.1 人工文本數(shù)據(jù)挖掘 采用人工文本挖掘方式，以丹參、水通道作為檢索詞，在中國期刊網(wǎng)檢索出與之相關(guān)的所有文獻(xiàn)(檢索范圍為2013 年5 月16 日前)，剔除不含信息的文獻(xiàn)，從中提取丹參作用于水通道的文獻(xiàn)信息。

采用人工文本挖掘方式，以Salvia miltiorrhiza、aquaporin 作為檢索詞，從PubMed 中檢索出與之相關(guān)的文獻(xiàn)(檢索范圍為2013 年5 月24 日前)，剔除不相關(guān)的文獻(xiàn)，從中提取相關(guān)文獻(xiàn)信息。

1.2 虛擬篩選與分子對(duì)接 臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫(Traditional Chinese Medicine Dadabase@ Taiwan)是目前全世界最大中醫(yī)藥小分子數(shù)據(jù)庫，里面包含來源于453 種不同中藥超過20 000 多種的化學(xué)成分。該數(shù)據(jù)庫還提供中藥小分子活性成分虛擬篩選、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬［3］，被譽(yù)為是彌補(bǔ)中藥與西藥分歧的橋梁［4］。

臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫逐漸得到推廣和應(yīng)用，目前文獻(xiàn)報(bào)道從數(shù)據(jù)庫中38877 個(gè)中藥化學(xué)分子篩選出sodium (+)-isolaricireinol-2 alpha-sulfate、sodium 3，4-dihydroxy-5-methoxybenzoic acid methy ester-4-sulfate 作為H1 藥物作用的靶分子［5］。并 篩 選 出2-O-caffeoyl tartaric acid，Emitine，Rosmaricine 和2-O-feruloyl tartaric acid 可能是潛在的EGFR 抑制劑［6］。

丹參作用于AQP4 活性成分虛擬篩選和分子對(duì)接工具采用臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫提供Iscreen 在線服務(wù)器［7］。

丹參活性成分由臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫提供，包括有脂溶性成分如丹參新酮、二氫丹參酮Ⅰ、二氫異丹參酮Ⅰ、去氫丹參新酮，水溶性成分丹參素、丹參酸B 等。數(shù)據(jù)庫中丹參一共收集了150 個(gè)化學(xué)成分可用于下一步活性篩選。該數(shù)據(jù)庫的化合物均通過Lipinski’s 類藥五原則，化合物3D 結(jié)構(gòu)均采用NM2 力場優(yōu)化［7］。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備是虛擬篩選和分子對(duì)接的重要一步。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB (http://www. rcsb. org/pdb/home/home.do)下載AQP4 晶體結(jié)構(gòu)，相對(duì)應(yīng)的PDB 文件是3GD8。采用分子模擬圖形界面軟件Discovery Studio Visualizer 3.5 刪除溶劑分子、去除自帶配體，加氫及修正不完整殘基等處理，并分析活性區(qū)域和核心氨基酸。處理好的蛋白用于下一步虛擬篩選與對(duì)接。Arg216 決定了AQP4 的通透性［8］，Arg216，Asp69 同時(shí)是與抑制劑arylsulfonamides 計(jì)算機(jī)對(duì)接中結(jié)合的核心氨基酸［9］。虛擬篩選與對(duì)接中，AQP4 蛋白活性結(jié)合區(qū)域范圍以Arg216，Asp69 核心氨基酸作為參照，其他參數(shù)采用默認(rèn)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照對(duì)接打分排序。

1.3 分子模擬圖像處理 丹參與活性成分分子對(duì)接采用分子圖形開源軟件pymol 分析處理作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人工文本檢索結(jié)果 查詢中國期刊網(wǎng)和Pubmed 數(shù)據(jù)庫，文獻(xiàn)證實(shí)丹參注射液、水煎液或含丹參的復(fù)方中藥可對(duì)多種AQPs 蛋白有作用，作用組織部位和相應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)目詳見表1。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道丹參作用于AQP4 有8 篇，其中作用于腦組織的AQP4 文獻(xiàn)為6 篇、1 篇作用于心肌細(xì)胞、1 篇作用于胃腸道AQP4。藥物包括有丹參川芎嗪注射液、丹紅注射液、含丹參的化濕液、腦脈泰膠囊等。

表1 丹參作用于AQPs 的文獻(xiàn)信息

但文獻(xiàn)報(bào)道多集中于提取物或復(fù)方上，對(duì)于作用于AQPs 的活性成分和分子機(jī)制闡述存在一定的困難。如采用傳統(tǒng)的方法，費(fèi)事費(fèi)力，因此，計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選提供了一個(gè)非常好的方法技術(shù)。

2.2 丹參作用于AQP4 虛擬篩選結(jié)果 虛擬篩選結(jié)果顯示，丹參150 個(gè)小分子中，與AQP4 對(duì)接打分較好分別是:3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 打分結(jié)果為-64.517 5，原兒茶酸protocatechuic acid 打分結(jié)果為-64.450 8，丹參素danshensu 的打分結(jié)果為-63.674 1。同時(shí)從表中可發(fā)現(xiàn)，前5 位小分子化合物打分結(jié)果接近，但與第6 位后小分子打分就有明顯的差別。詳細(xì)可見表2。這些化合物可作為AQPs 抑制劑的先導(dǎo)化合物做進(jìn)一步研究。

2.3 對(duì)接結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的丹參小分支，并探討與AQP4 的結(jié)合模式，我們考察了它們的相互作用。

3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 與AQP4 蛋 白 中Gly146、Asn206、Gly209、Arg216 形成氫鍵連接(圖1A)。原兒茶酸protocatechuic acid 與AQP4 蛋白的 Gly146、Gly209、Arg216 形成氫鍵連接，同時(shí)還與兩個(gè)水分子形成氫鍵連接(圖1B)。丹參素danshensu 與AQP4 蛋白Thr56、Gly146、Val147、Gly209、Arg216 形成氫鍵連接，同時(shí)還與一個(gè)水分子形成氫鍵連接(圖1C)。

氫鍵連接在圖2 中得到更清楚的展示。3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 與AQP4 的Arg216 形成兩個(gè)N…OH 氫鍵，與Asn206 形成1 個(gè)N…O-H 氫鍵，鍵長分別是2.88、2.81、2.72 ? (圖2a)。原兒茶酸protocatechuic acid與AQP4 蛋白Arg 形成兩個(gè)N…O-H 氫鍵，鍵長分別為2.91、2.81 ?，與Val147 形成O…O-H 氫鍵，鍵長為3.09 ? (圖2b)。丹參素danshensu 與AQP4 蛋白Arg216 形成兩個(gè)N…O-H 氫鍵，與Gly146 形成一個(gè)N…O-H 氫鍵，與Thr56 形成兩個(gè)O…O-H 氫鍵(圖2c)。

同時(shí)還從圖2 中觀察到疏水作用，紅色睫毛狀為殘基的疏水作用示意。從圖2 中可發(fā)現(xiàn)3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 與較多的氨基酸發(fā)生了疏水作用，而原兒茶酸protocatechuic acid 和丹參素danshensu 的疏水作用相對(duì)較少。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，血與津液同屬于液態(tài)物質(zhì)，津血同源、津血轉(zhuǎn)換，都有滋潤和濡養(yǎng)作用，生理上可相互轉(zhuǎn)換和相互補(bǔ)充，病理上相互影響。丹參作為活血化瘀傳統(tǒng)中藥，對(duì)津液水液同樣具有很強(qiáng)的作用。AQPs 與人體泌尿、消化、呼吸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，它的正常表達(dá)可能是運(yùn)化水濕、津液輸布的分子生物學(xué)基礎(chǔ)［2］。通過人工文獻(xiàn)檢索，我們可發(fā)現(xiàn)丹參水煎液、丹參注射液或含丹參的復(fù)方可對(duì)亞型AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、都有作用(表1)。

表2 Iscreen 虛擬篩選出的高匹配打分的丹參活性成分

圖1 丹參成分與AQP4 分子對(duì)接模式圖

圖2 丹參活性成分與AQP4 相互作用力示意圖

AQP4 是腦組織分布最廣泛的蛋白，分布于內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中，參與細(xì)胞內(nèi)外水調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，在腦組織水平衡中起重要作用［18-19］。在許多心腦血管疾病中，丹參通過調(diào)節(jié)AQP4 蛋白發(fā)揮重要作用。大鼠手術(shù)腦缺血再灌注致使腦組織含水量增多、損傷加重，而預(yù)先給予丹參川芎嗪可以改善大鼠神經(jīng)損傷、減輕腦水腫、降低AQP4 表達(dá)水平［20］。腦脈泰膠囊由紅參、三七、當(dāng)歸、丹參、銀杏葉、山楂等組成，在大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法導(dǎo)致的局灶性腦缺血再灌注模型中，脈泰膠囊具有保護(hù)和減輕腦水腫的作用，可能與其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低AQP4 表達(dá)，減少線粒體和血腦屏障的損傷有關(guān)［21］。腹腔注射丹紅注射液可降低大鼠急性腦損傷后腦水腫、AQP4 的表達(dá)及神經(jīng)元的凋亡，對(duì)腦損傷有明顯的治療作用［15］。在心肌缺血再灌注大鼠模型中，復(fù)方丹參滴丸或健心平律丸能減輕心肌缺血水腫損傷及增強(qiáng)心肌細(xì)胞AQP4 表達(dá)［16］。

Iscreen 是基于臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫的、以高精度PLANTS 和LEA3D 軟件包作核心的云端中草藥虛擬篩選與分子對(duì)接的在線服務(wù)器［7］。通過Iscreen 虛擬篩選和分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)150 個(gè)丹參小分子中3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、Protocatechuic acid、Danshensu 與AQP4 蛋白結(jié)合較好(見表2)。

丹參小分子與AQP4 配體-受體結(jié)合圖具體可見圖1。丹參小分子3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu 均與Arg216 有氫鍵作用(見圖1)。AQPs 水通透效率與通道區(qū)域氨基酸所帶正電荷密切相關(guān)，Arg216 決定了AQP4 的通透性［8］。Protocatechuic acid、danshensu 也都與AQP4 蛋白在Gly209 位也形成了氫鍵作用(圖1B，圖1C)。AQP4 蛋白Phe77、Ile81、Val85、Leu170、Ile174、Val197 組成了疏水部分，Gly209、Ala210、Ser211、Met212 則組成了親水部分，這樣可以保證水在水通道中的雙向性［8］。這說明了Protocatechuic acid、danshensu 可能也參與水通透的雙向性調(diào)節(jié)。Danshensu 與AQP4 蛋白Thr56形成了氫鍵(圖1C)。根皮素Phloretin 與AQP4 蛋白Thr56，Ile73，Ile205 形成疏水作用［9］。這些都說明了這3 種丹參小分子與AQP4 核心氨基酸存在著相互作用力。

AQP4 蛋白Arg216，His201 直接位于通道中間，將通道直徑縮至1.5 埃［8］，這一部位是抑制劑arylsulfonamides，sumatriptan 發(fā)揮作用的關(guān)鍵部位［9，22］。丹參小分子3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu與AQP4 蛋白Arg216 殘基發(fā)生結(jié)合后，推測其也起到了通道阻塞從而影響胞內(nèi)外水的進(jìn)出，發(fā)揮門控作用。因此，可推測這3 個(gè)小分子可發(fā)揮AQP4 通道抑制劑的功能。

綜上所述，丹參與AQP4 關(guān)鍵氨基酸存在相互作用，并可能起到水通道抑制作用，對(duì)生理病理?xiàng)l件下AQP4 蛋白功能的發(fā)揮可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)束語

本研究采用TCM Database@Taiwan 和Iscreen 在線虛擬篩選和分子對(duì)接方法，從丹參中篩選出3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu 與AQP4結(jié)合較好，并分析了配體-受體的活性位點(diǎn)的結(jié)合模式。這有利于進(jìn)一步了解丹參活血化瘀機(jī)制，對(duì)其在心腦血管疾病中發(fā)揮作用具有理論支持作用。

致謝:感謝創(chuàng)騰公司免費(fèi)提供分子模擬圖形界面軟件Discovery Studio Visualizer 3.5 (Accelrys 公司出品)。

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