小兒氨酚黃那敏顆粒中人工牛黃和體外培育牛黃的研究

張軼華， 姜建國， 孫 婷， 郭永輝

(河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊050011)

小兒氨酚黃那敏顆粒為感冒用藥類非處方藥藥品，適用于緩解兒童普通感冒及流行性感冒引起的發(fā)燒、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等癥狀。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)第三冊［1］，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定處方為:對乙酰氨基酚125 g、馬來酸氯苯那敏0.5 g、人工牛黃5 g 和輔料適量，制成1 000 袋。但在市場上發(fā)現(xiàn)有的企業(yè)使用體外培育牛黃代替人工牛黃，處方量不變，仍執(zhí)行該現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。人工牛黃由膽酸、豬去氧膽酸、牛膽粉、膽紅素、微量元素等原料藥物混合配制而成;體外培養(yǎng)的牛黃是國家一類新藥，是以牛科動物牛的新鮮膽汁作母液，加入去氧膽酸、膽酸、復(fù)合膽紅素鈣等制成的棕黃色球形物。已有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)人工牛黃和體外培育牛黃的測定［2-7］，但未見如何區(qū)分二者的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了小兒氨酚黃那敏顆粒中人工牛黃和體外培育牛黃中膽酸和豬去氧膽酸的TLC 鑒別方法，并建立了測定二者中膽紅素的HPLC 測定方法，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，能更好地控制藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國戴安公司);紫外分析儀(北京六一儀器廠);硅膠GF254板(青島海洋化工廠);對照品膽酸(批號100078-200414，純度為100%)，豬去氧膽酸(批號100087-200610，純度為100%)，膽紅素 (批號100077-201206;純度為98.5%)均購自中國藥品生物制品檢定研究院;小兒氨酚黃那敏顆粒樣品(A 廠，批號20110307;B 廠，批號110102;C 廠，批號110401;D 廠，批號11050329;E 廠，批號066110772;F 廠，批號120504;G 廠，批號1203112;H 廠，批號4110902)，樣品為復(fù)方制劑，來自8 家不同企業(yè)，各1 批，2 家企業(yè)(A 和B)使用體外培育牛黃，其余企業(yè)均采用人工牛黃。

甲醇為色譜純(Fisher chemical)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人工牛黃和體外培育牛黃的TLC 鑒別

2.1.1 薄層色譜條件 薄層板為硅膠G 板(青島海洋化工廠)，展開劑為異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15 ∶7 ∶5)，點(diǎn)樣量為5 μL，展開后晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別稱取膽酸和豬去氧膽酸適量，加甲醇制成每1 mL 中含1 mg 的混合對照品溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于人工牛黃20 mg)，加三氯甲烷50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照的制備 除去人工牛黃或體外培育牛黃，模擬處方(分別取各輔料的最大量)按樣品溶液的制備方法，制成陰性對照液。

2.1.5 樣品測定結(jié)果 對照品溶液在紫外燈(365 nm)下檢視可見2 個(gè)藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)，分離度良好。A 和B 企業(yè)采用體外培育牛黃僅檢出膽酸，其他企業(yè)均檢出膽酸和豬去氧膽酸。這與人工牛黃和體外培育牛黃的組成完全吻合。該方法可以快速地區(qū)分是否采用體外培育牛黃，TLC 圖見圖1。

圖1 膽酸和豬去氧膽酸的TLC 鑒別圖Fig.1 TLC identify picture of cholalic acid and hyodeoxycholic acid

2.2 人工牛黃和體外培育牛黃中膽紅素的HPLC法測定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZOBAX C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動相為甲醇-三氯甲烷-0.1%磷酸(88 ∶6 ∶6);檢測波長449 nm;進(jìn)樣量10 μL;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取膽紅素對照品10 mg，置100 mL 棕色量瓶中，加三氯甲烷-甲醇-水-鹽酸(90 ∶10 ∶0.3 ∶0.03)混合液適量，超聲使膽紅素溶解并稀釋至刻度，搖勻;再精密量取2 mL，置25 mL 棕色量瓶中，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品5 袋內(nèi)容物，置100 mL 錐形瓶中，精密加三氯甲烷-甲醇-水-鹽酸(90 ∶10 ∶0.3 ∶0.03)混合液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，取出，迅速冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用上述混合液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.2.4 空白溶液的制備 按處方比例，按供試品溶液的制備方法，制備不含人工牛黃或體外培育牛黃的空白樣品。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密量取對照品溶液、供試品溶液及空白樣品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，對照品溶液與樣品溶液主峰的保留時(shí)間一致，其他共存組分(對乙酰氨基酚和馬來酸氯苯那敏)及空白樣品溶液均對測定膽紅素?zé)o干擾。見圖2。

2.2.6 線性關(guān)系 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液逐級稀釋，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，以各組分峰面積為縱坐標(biāo)對相應(yīng)的質(zhì)量回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=19.077 +6 697.3x，r =0.999 2，表明在0.01 ～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 對照品和樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substance and sample

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次，測定峰面積，膽紅素峰面積的RSD 為0.8% (n=5)。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取C 廠樣品按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，平行制備5 份，進(jìn)樣10 μL 測定，膽紅素的含有量平均值為0.028 2 mg/袋，RSD 為0.6% (n=5)。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取C 廠樣品溶液，于避光陰涼處放置，2 h 為穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測定含有量的C廠樣品(2.5 袋)，平行9 份，分別精密量取膽紅素對照品貯備液1.6、2、2.4 mL，回收率均在98.6%以上。

2.2.11 樣品測定 對8 個(gè)廠家的樣品進(jìn)行膽紅素的定量測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.1 Results of bilirubin content (±s，n=3)

表1 測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.1 Results of bilirubin content (±s，n=3)

廠家 批號 膽紅素/(mg/袋)20110307 0.27 ±0.2 B 110102 0.70 ±0.3 C 110401 0.028 ±0 D 11050329 0.029 ±0.4 E 066110772 0.027 ±0.6 F 120504 0.026 ±0.8 G 1203112 0.017 ±0.4 A H 4110902 0.022 ±0

3 討論

3.1 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用顯色反應(yīng)鑒別人工牛黃中的膽酸，由于各企業(yè)添加的輔料不同，溶液呈現(xiàn)的顏色也不盡相同，有的藍(lán)紫色明顯，但深淺不一，有的則略呈棕黃色，見圖3，很難判斷樣品是否合格，且該鑒別方法無法區(qū)分人工牛黃和體外培育牛黃。本實(shí)驗(yàn)采用的方法可同時(shí)鑒別膽酸和豬去氧膽酸，也可快速區(qū)分人工牛黃和體外培育牛黃，以避免不良廠家以人工牛黃冒充價(jià)格昂貴的體外培育牛黃。

3.2 人工牛黃和體外培育牛黃中均以膽紅素的價(jià)格最高，體外培育牛黃中的膽紅素量約為人工牛黃中的10 倍以上，因此應(yīng)對膽紅素量進(jìn)行控制，并規(guī)定限度分別為0.027mg/袋和0.27mg/袋。從表1中，可以看出由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未對膽紅素的量進(jìn)行控制，存在企業(yè)底限投料和少投料的現(xiàn)象。

圖3 顯色反應(yīng)的顏色對比圖Fig.3 Colour contrast of solution

3.3 人工牛黃和體外培育牛黃的組成不同，但處方量均為5 mg/袋，且執(zhí)行同一標(biāo)準(zhǔn)，顯然不合理，建議分別制訂處方和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無法區(qū)分人工牛黃和體外培養(yǎng)牛黃，未對膽紅素的含有量進(jìn)行控制，因此市場上存在以次充好，投料不足等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)擬定的檢測方法，操作簡便，可快速區(qū)分人工牛黃和體外培養(yǎng)牛黃，準(zhǔn)確地測定膽紅素量，也可對不良廠家提出警示，從而提高藥品的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］ WS-10001-(HD-0214)-2002，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn):第三冊［S］. 2002:53-54.

［2］ 楊洪武，王 崢，辛敏通，等. 薄層掃描法測定人工牛黃及其制劑中膽酸的含量［J］. 中成藥，2003，25(4):290-293.

［3］ 葉蓓蓓，潘 莉，王 棟，等. 薄層掃描法同時(shí)測定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量［J］. 藥物分析雜志，2010，30(4):706-709.

［4］ 方建國，王文清，蔣 平，等. 反相高效液相色譜法測定體外培育牛黃中膽紅素的含量［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25(7):694-695.

［5］ 石 巖，孫冬梅，魏 鋒，等. 體外培育牛黃中主要膽酸類成分的測定［J］. 藥物分析雜志，2013，33 (6):1045-1047.

［6］ 張啟明，嚴(yán)克東，錢麗華. 氣相色譜法測定牛黃中膽固醇的含量［J］. 中國中藥雜志，1991，16(7):426-428.

［7］ 方建國，王文清，蔣 平，等. 牛黃息炎痛膠囊中膽紅素的含量測定［J］. 藥物分析雜志，2002，22(3):198-200.