三葉青黃酮對肺癌A549細(xì)胞生長抑制與MAPKs通路關(guān)系的研究

鐘良瑞，魏克民

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬省立同德醫(yī)院腫瘤科，浙江 杭州 310053;2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人類的健康;因此，開發(fā)安全有效的新藥具有重要意義。三葉青屬于葡萄科崖爬藤屬植物(Tetrastigma hemsleyanumDielset)，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的作用［1］。近年來，三葉青的抗腫瘤作用備受關(guān)注;前期研究表明三葉青具有明顯的抗腫瘤作用［2－3］。有研究表明［4］三葉青對肺癌A549細(xì)胞有抑制增殖和促凋亡作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)探討三葉青黃酮(radix tetrastigma hemsleyani flavone，RTHF)對人肺癌 A549細(xì)胞促凋亡及其作用機(jī)制具有可行性，為三葉青進(jìn)一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 A549細(xì)胞株由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，浙江中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)所用為生長狀況良好的細(xì)胞。

1.2 藥品與試劑 三葉青:購自浙江省中醫(yī)藥研究院，由浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取制備;RPMI 1640培養(yǎng)液:杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;Hyclone胎牛血清;CCK-8:日本同仁化學(xué)研究所;Hoechst 33258染色液:碧云天生物技術(shù)研究所;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒:南京凱基生物技術(shù)有限公司;p-p38、p-ERK、p-JNK:美國CST公司。

1.3 儀器 3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國Thermo公司;3001型酶標(biāo)儀:美國Thermo公司;IX71型熒光顯微鏡:日本OLYMPUS公司;流式細(xì)胞儀:美國BD公司;蛋白印記檢測系統(tǒng):美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)液含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，條件為37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞長至瓶底80%左右，用胰酶消化，傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8檢測生長抑制率 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，制備成5×107·L－1的細(xì)胞懸液，按每孔100 μl接種于96孔板，貼壁后更換培養(yǎng)液并加不同濃度三葉青黃酮(0、0.5、1、5、10 g·L－1)分5 組，每組6 復(fù)孔;分別在24、48、72 h檢測，450 nm處測定各孔吸光度A值。根據(jù)公式:抑制率/%=(1－加藥組A值/對照組A值)×100%，計(jì)算不同濃度三葉青黃酮對A549細(xì)胞的抑制率。

2.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度的三葉青黃酮(0、1、5、10 g·L－1)處理 48 h后，吸除培養(yǎng)液;加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗，加入Hoechst 33258避光染色5 min;PBS漂洗，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞懸液接種于6孔板;細(xì)胞貼壁后，加不同濃度三葉青黃酮(0、1、5、10 g·L－1)。作用48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入500 μl的結(jié)合緩沖液Bind Buffer懸浮細(xì)胞，先后加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測分析，激發(fā)波長為488 nm。

2.5 Western blot檢測MAPKs通路相關(guān)蛋白的影響 冰上操作，刮下細(xì)胞，移至1.5 ml離心管。每瓶細(xì)胞加 250～500 μl RIPA 裂解液，1200 r·min－1離心 5 min，收獲蛋白，測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗室溫孵育2～3 h，二抗室溫孵育1 h。室溫下，ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反應(yīng)3～5 min，放入蛋白印記檢測系統(tǒng)的暗箱內(nèi)，在暗室中，曝光、顯影、定影。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。統(tǒng)計(jì)描述:計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示。組間比較采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 三葉青黃酮對A549細(xì)胞生長抑制率 不同濃度三葉青黃酮作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后，CCK-8檢測顯示三葉青黃酮對A549細(xì)胞有明顯抑制作用，隨濃度的增加、時(shí)間延長，抑制率逐漸增高，呈劑量、時(shí)間依賴性。見Tab 1。

Tab 1 Inhibitory ratio of RTHF at different concentrations on growth of A549(%，±s，n=6)

Tab 1 Inhibitory ratio of RTHF at different concentrations on growth of A549(%，±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

－1 0.5 1 5 10 24 h 4.56±0.69 9.62 ±1.35 26.00±2.30＊＊ 55.77 ±2.30 Time RTHF concentration/g·L＊＊48 h 9.97±1.16* 24.49 ±1.91＊＊ 44.69±1.80＊＊ 67.50 ±1.60＊＊72 h 24.17±2.04＊＊ 45.34 ±1.77＊＊ 68.14±0.78＊＊ 71.57 ±0.92＊＊

3.2 三葉青黃酮對A549細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響不同濃度三葉青黃酮作用于A549細(xì)胞48 h后，經(jīng)Hoechst 33258染色結(jié)果表明:對照組細(xì)胞呈均勻藍(lán)色熒光(Fig 1a);1 g·L－1低濃度組細(xì)胞核顏色稍亮(Fig 1b);5 g·L－1中濃度組部分細(xì)胞核呈致密濃染，顏色變亮(Fig 1c);10 g·L－1高濃度組細(xì)胞凋亡最明顯，完整細(xì)胞核結(jié)構(gòu)少見 (Fig 1d)。隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡形態(tài)逐漸明顯。

3.3 流式細(xì)胞儀檢測三葉青黃酮對A549細(xì)胞凋亡率 與空白對照組相比，經(jīng)藥物處理48 h后細(xì)胞凋亡的比例均有明顯升高，且呈現(xiàn)一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見Fig 2。

Fig 1 Microscopic images of A549 cultured with RTHF for 48h(Hoechst 33258，200 × )

Fig 2 Flow cytometric testing apoptosis of A549 cultured withRTHF at different concentrations for 48h

3.4 不同濃度三葉青黃酮對A549細(xì)胞MAPKs通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，不同濃度三葉青黃酮處理細(xì)胞后，隨著藥物濃度增加，p-p38、p-ERK蛋白表達(dá)明顯升高，p-JNK蛋白表達(dá)無明顯變化。見Fig 3。

4 討論

Fig 3 Expression of apoptosis-related MAPKs signal pathway proteins of A549 cultured with RTHF

本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8證實(shí):三葉青黃酮對人肺癌細(xì)胞株A549的生長有明顯抑制作用，且有濃度、時(shí)間依賴性，其中三葉青黃酮濃度為10 g·L－1、作用72 h時(shí)，對細(xì)胞的抑制率最高。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，通過分子水平進(jìn)行調(diào)控，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)Hoechst 33258染色后的A549細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，顏色變亮，出現(xiàn)增強(qiáng)的藍(lán)色熒光，部分細(xì)胞核出現(xiàn)新月狀亮藍(lán)色熒光邊集于核膜下;高濃度時(shí)幾乎無完整的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。流式分析Annexin V-FITC和PI雙染，顯示三葉青黃酮可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，且與濃度呈正相關(guān)。誘導(dǎo)凋亡是多數(shù)抗腫瘤藥物的主要機(jī)制，本研究證實(shí)三葉青黃酮可以明顯誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡。

MAPK(mitogen-activated protein kinase)是絲裂原活化蛋白激酶，MAPKs信號通路是真核細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程［5］。包含3條并行的 MAPKs信號通路:①ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(extracellular signal regulated protein kinases)即Ras-to-MAPK通路，包括ERKl和ERK2，是MAPKs系統(tǒng)經(jīng)典通路;②JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;③p38-MAPK通路。

ERK是被克隆并鑒別最早的MAPK家族成員［6］，ERK級聯(lián)反應(yīng)主要作用于細(xì)胞的增殖分化，在癌癥中常被激活。有研究發(fā)現(xiàn)［7］ERK通路在肺腺癌形成早期階段已被激活。JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)，JNK信號傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)［9］JNK 途徑在肺癌細(xì)胞的生長和凋亡方面起著重要作用。p38蛋白激酶為38 ku酪氨酸磷酸化蛋白激酶，p38通路既可影響肺癌的發(fā)生發(fā)展［10］，又可作為評估肺癌預(yù)后指標(biāo)，p38表達(dá)陽性的患者預(yù)后較差。Mu等［11］研究發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素誘導(dǎo)肺癌PC-14細(xì)胞凋亡的作用與激活p38通路相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測結(jié)果顯示與對照組相比，隨三葉青黃酮濃度增加，pp38和p-ERK蛋白表達(dá)水平升高，p-JNK表達(dá)無明顯變化，提示三葉青黃酮可能通過激活p38MAPK途徑和ERK途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

綜上所述，三葉青黃酮對肺癌A549細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，通過增加p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)，激活p38MAPK途徑和ERK途徑可能是其凋亡機(jī)制之一。

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