以Insig-2基因啟動子為靶點的藥物篩選模型的建立

張 琴，楊發(fā)建，何 蕓，楊俊霞

(重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

胰島素誘導基因2(insulin-induced gene 2，Insig-2)是Yabe等［1］通過生物信息學技術(shù)與Insig-1比較而發(fā)現(xiàn)的調(diào)控脂肪分化與脂質(zhì)代謝的新基因，主要在肝臟和脂肪組織中表達，兩者序列同源性為59%。其編碼的INSIG-2蛋白是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，通過與膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)及 SREBPs裂解活化蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)結(jié)合，以INSIG-2-SREBPs-SCAP復合物形式附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，阻止SCAP護送SREBPs至高爾基體，阻斷SREBPs在高爾基體中裂解活化，從而抑制脂肪細胞分化及脂質(zhì)合成［2］，此外Insig-2還可促進膽固醇合成中的限速酶HMG-CoA快速降解，從而抑制膽固醇合成［3］，可見Insig-2在維持細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是目前從分子水平用于研究分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效工具，具有快速、靈敏、簡便、不需要使用放射性同位素、可重復的消除預測結(jié)果假陽性等優(yōu)點［4］。目前國內(nèi)外尚未見基于該方法的以Insig-2基因為靶點的脂質(zhì)代謝類藥物篩選模型的報道。

本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGL3-Insig-2，將其與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時共轉(zhuǎn)染工具細胞，調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例，處以不同藥物進行比較，構(gòu)建以Insig-2基因啟動子為靶點的藥物篩選模型，為進一步研究Insig-2基因表達的作用機制和篩選以Insig-2基因啟動子為靶點的脂質(zhì)代謝類藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 HEK293人胚腎細胞和HepG2人肝癌細胞由重慶醫(yī)科大學生物化學與分子藥理學重點實驗室保存，3T3-L1前脂肪細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、MluⅠ、T4 DNA連接酶購自 TOYOBO公司;LipofectamineTM2000試劑購自Invitrogen公司;質(zhì)粒pGL3-basic和pRL-TK、Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司。1，25-(OH)2D3購自Sigma公司，鹽酸小檗堿購自重慶鼎國生物技術(shù)有限公司，姜黃素由重慶醫(yī)科大學生物化學與分子藥理學重點實驗室保存。

1.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒 將人Insig-2基因啟動子片段連接到pTA2載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pTA2-Insig-2。用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和KpnⅠ雙酶切pTA2-Insig-2后并純化，克隆至經(jīng)MluⅠ和 KpnⅠ雙酶切的pGL3-basic載體，以T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，雙酶切鑒定篩選陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒 pGL3-Insig-2，送至重慶金麥公司進行DNA測序鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞 取對數(shù)生長期HEK293人胚腎細胞、HepG2人肝癌細胞和3T3-L1前脂肪細胞，以每孔5.0×105個細胞，接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，每組做3個復孔。待細胞生長至80%左右，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書，采用瞬時轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pGL3-Insig-2和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染不同細胞。

1.4 藥物處理 分別用無水乙醇、DMSO和無水乙醇溶解，配制1，25-(OH)2D3、小檗堿和姜黃素原液，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h后，加入不同濃度的1，25-(OH)2D3，小檗堿和姜黃素，每個藥物濃度設(shè)置3個復孔，藥物干預48 h后進行雙熒光素酶報告基因檢測。

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測 每孔細胞用 PBS洗滌2次，分別加入細胞裂解液，置搖床上，室溫120 r·min－1，振搖20 min，收集細胞裂解液。取細胞裂解液上清20 μl，加入熒光素酶檢測試劑Ⅱ100 μl，用化學發(fā)光檢測儀 LumunometerTD-20/20(美國Turner Bio Systems公司產(chǎn)品)檢測螢火蟲熒光素酶活性;再加入海腎熒光素酶檢測試劑(Stop Glo試劑)100 μl，將上述反應(yīng)猝滅，并啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，檢測海腎熒光素酶活性。熒光素酶活性用每組螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值來表示(即啟動子活性)，按如下公式計算:啟動子活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 鑒定重組質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶Kpn I和 Mlu I雙酶切重組質(zhì)粒pGL3-Insig-2，通過瓊脂糖凝膠電泳成像顯示在1 400 bp和4 400 bp處有特異性條帶，與Insig-2啟動子目的片段和空載質(zhì)粒pGL3-basic片段大小相一致(Fig 1)。DNA測序結(jié)果顯示與GenBank中登錄的Insig-2基因序列完全一致，證實重組質(zhì)粒pGL3-Insig-2構(gòu)建成功。

Fig 1 Restriction map of recombinant plasmid pGL3-insig-2(KpnⅠ/MluⅠ)

2.2 共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例摸索 為了獲得較強的啟動子活性，本實驗對報告基因pGL3-Insig-2和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染比例進行了探索，設(shè)置pGL3-Insig-2:pRL-TK的轉(zhuǎn)染比例為16∶1和4∶1兩組，分別轉(zhuǎn)染HEK293、HepG2和3T3-L1細胞。結(jié)果表明，在3株細胞中均呈現(xiàn)出當兩者比例為4∶1時，Insig-2啟動子活性更強，分別是兩者比例為16∶1時的9.39倍、5.61倍和11.37倍(Fig 2)。因此，本實驗選擇兩者比例為4∶1進行后續(xù)研究。

2.3 工具細胞選擇 將pGL3-basic空載質(zhì)粒和pGL3-Insig-2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293、HepG2、3T3-L1細胞，同時共轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK，探索不同細胞中Insig-2基因啟動子活性。結(jié)果顯示，與pGL3-basic相比，在3株細胞中pGL3-Insig-2重組質(zhì)粒均具有啟動子活性，分別為pGL3-basic的14.18倍、40.40倍和214.62倍，可見該啟動子活性在3T3-L1細胞中最高，其次為HepG2細胞，最低為 HEK293細胞(Fig 3)，因此本模型確定選擇3T3-L1細胞為藥物篩選的工具細胞。

Fig 2 Effect of different plasmid ratios on Insig-2 promoter activity

Fig 3 Insig-2 promoter activity in different cells

2.4 不同藥物對Insig-2基因啟動子活性的影響

2.4.11 ，25-(OH)2D3采用 1，25-(OH)2D3來作為陽性藥物驗證該篩選方法是否可行，結(jié)果如Fig 4所示，10 nmol·L－1和100 nmol·L－1的1，25-(OH)2D3處理3T3-L1 細胞，與空白對照組相比，Insig-2基因啟動子的活性呈劑量依賴性明顯增強，兩者比較差異有顯著性(P＜0.01)，說明該篩選方法可以用于篩選脂質(zhì)代謝類藥物的研究，同時說明雙熒光素酶報告基因法檢測Insig-2基因啟動子活性靈敏性較高。

2.4.2 小檗堿 本實驗檢測了小檗堿是否對Insig-2基因啟動子活性有影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，加入不同濃度的小檗堿處理3T3-L1細胞，Insig-2基因啟動子的活性均明顯增強(P＜0.01)，從 5 μmol·L－1開始小檗堿即可呈劑量依賴性增強 Insig-2基因啟動子活性，在20 μmol·L－1濃度時達到峰值(Fig 5)。

Fig 4 Effects of 1，25-(OH)2D3on Insig-2 promoter activity in 3T3-L1 cells

2.4.3 姜黃素 本實驗檢測了姜黃素對Insig-2基因啟動子活性的影響。實驗結(jié)果顯示，用 5、10、20、30 μmol·L－1姜黃素處理3T3-L1細胞，與空白對照組相比，Insig-2基因啟動子的活性均明顯增強(P＜0.01)，當姜黃素濃度低于20 μmol·L－1時，Insig-2基因啟動子活性呈劑量依賴性增強，濃度達20 μmol·L－1時Insig-2基因啟動子活性最高(Fig 6)。

3 討論

隨著人類生活水平的提高，心血管疾病已發(fā)展成為人類健康的“第一殺手”，其發(fā)病率、死亡率都在逐年增加，而脂質(zhì)代謝障礙是高血壓、冠心病等各種心血管疾病發(fā)病的主要原因之一。Insig-2是一類與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的基因，研究證明Insig-2能抑制成熟脂肪細胞的脂肪合成，并阻斷前脂肪細胞的分化［5］，且Insig-2過表達能減少Zucker糖尿病肥胖大鼠和禁食再喂正常大鼠的脂肪合成，而將Insig2基因敲除，則得到完全相反的結(jié)果，脂肪在這些組織中大量聚集［6］。說明Insig-2基因在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，因此，開發(fā)以Insig-2基因啟動子為靶點的脂質(zhì)代謝類藥物具有重大意義。

Fig 6 Effects of Curcumin on Insig-2 promoter activity in 3T3-L1cells

在新藥研發(fā)過程中，構(gòu)建藥物篩選模型是至關(guān)重要的，可以減少藥物研發(fā)的時間。雙熒光素酶檢測法采用螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶雙報告基因，一個報告基因作為內(nèi)對照，減少內(nèi)在變化因素的影響，使另一個報告基因的檢測均一化，與傳統(tǒng)的熒光素酶報告基因檢測法相比，提高了檢測的準確性和靈敏度，操作簡便，將此方法用于藥物篩選模型中具有一定的價值。本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞，雙熒光素酶法檢測，成功構(gòu)建以Insig-2基因啟動子為靶點的藥物篩選模型，根據(jù)信號比和靈敏度，確立了實驗最佳條件:選擇pGL3-Insig-2和pGL-RK的共轉(zhuǎn)染比例為4∶1，確定3T3-L1細胞為工具細胞以進行后續(xù)藥物篩選實驗。

鑒于Insig-2基因啟動子中存在維生素D反應(yīng)元件(vitamin D response element，VDRE)，該元件作為一種配體依賴性核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能調(diào)節(jié)Insig-2基因的表達，其配體1，25-(OH)2D3可作用于Insig-2啟動子中VDRE，促進Insig-2基因轉(zhuǎn)錄，進而抑制脂肪細胞分化和脂質(zhì)形成［7－8］。因此，本實驗采用1，25-(OH)2D3作為陽性藥來驗證該篩選方法是否可行，結(jié)果顯示1，25-(OH)2D3能明顯增強Insig-2基因啟動子的活性，與已報道結(jié)果相似，說明藥物篩選模型構(gòu)建成功。小檗堿具有明顯的調(diào)血脂作用，其機制不同于經(jīng)典的他汀類和貝特類降脂藥物，可通過促進LDL受體表達，激活腺苷酸活化蛋白激酶等途徑發(fā)揮功效［9－10］。本課題組前期研究則發(fā)現(xiàn)小檗堿調(diào)血脂的機制可能與促進肝臟和脂肪組織Insig-2和VDR基因表達有關(guān)［11－12］。但其調(diào)節(jié)Insig-2基因表達的分子機制尚不明了，其對Insig-2基因的上調(diào)作用是初始靶點還是其上游基因VDR產(chǎn)生的后繼效應(yīng)所致呢?為此，本實驗在篩選出最佳條件的作用下，加入不同濃度的小檗堿處理，觀察小檗堿是否能直接作用于Insig-2基因啟動子，結(jié)果表明小檗堿呈劑量依賴性增強Insig-2基因啟動子活性，在20 μmol·L－1時達到峰值。姜黃素也是傳統(tǒng)的具有明顯的降膽固醇作用的天然植物藥，體內(nèi)外實驗證實姜黃素能抑制3T3-L1細胞分化并促進其凋亡，減輕高脂飲食喂養(yǎng)C57小鼠的體重［13］，其作用機制可能為促進細胞表面LDLR的表達，增強細胞內(nèi)膽固醇的吸收和利用［14］，也可通過抑制TNF-α和兒茶酚胺的作用而發(fā)揮改善脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)堆積的作用［15］。因此本實驗也檢測了姜黃素是否屬于Insig-2基因表達上調(diào)劑，結(jié)果顯示姜黃素可增強Insig-2基因啟動子活性，提示Insig-2可能是姜黃素調(diào)脂作用的重要作用靶點。

綜上所述，本實驗構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-Insig-2，將其與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時共轉(zhuǎn)染工具細胞，采用雙熒光素酶法檢測基因啟動子活性，建立了以Insig-2基因啟動子為靶點的藥物篩選模型，為篩選以Insig-2基因為靶點的脂質(zhì)代謝類藥物提供了一種有效的方法，同時也豐富和發(fā)展了1，25-(OH)2D3、小檗堿和姜黃素在抑制膽固醇合成和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝水平方面的機制研究。

［1］Yabe D，Brown M S，Goldstein J L.Insig-2，a second endoplasmic reticulum protein that bind SCAP and blocks of sterol regulatory element-binding proteins［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(20):12753－8.

［2］Dong X Y，Tang S Q.Insulin-induced gene:a new regulator in lipid metabolism［J］.Peptides，2010，31(11):2145 －50.

［3］Nguyen A D，Lee S H，DeBose-Boyd R A.Insig-mediated，sterol-accelerated degradation of the membrane domain of hamster 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in insect cells［J］.J Biol Chem，2009，284(39):26778－88.

［4］Dyer B W，F(xiàn)errer F A，Klinedinst D K，et al.A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis［J］.Anal Biochem，2000，282(1):158－61.

［5］Krapivner S，Popov S，Chernogubova E，et al.Insulin-induced gene 2 involvement in human adipocyte metabolism and body weight regulation［J］.J Clin Endocrinol Met，2008，93(5):1995－2001.

［6］Takaishi K，Duplomb L，Wang M Y，et al.Hepatic Insig-1 or-2 overexpression reduces lipogenesis in obese Zucker diabetic fatty rats and in fasted/refed normal rats［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(18):7106－11.

［7］Lee S，Lee D K，Choi E，et al.Identification of a functional vitamin D response element in the murine Insig-2 promoter and its potential role in the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes［J］.Mol Endocrinol，2005，19(2):399 －408.

［8］Kong J，Li Y C.Molecular mechanism of 1，25-dihydroxyvitamin D3 inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells［J］.Am J Physiol Endocrinol Met，2006，290(5):E916 －24.

［9］Kong W，Wei J，Abidi P，et al.Berberine is a novel cholestero-1owering drug working through a unique mechanism distinct from statins［J］.Nat Med，2004，10(12):1344 －51.

［10］Brusq J M，Amcellin N，Grondin P，et al.Inhibition of lipid synthesis through activation of AMP-kinase:an additional mechanism for the hypolipidemic effects of berberine［J］.J Lipid Res，2006，47(6):1281－8.

［11］常 偉，王 紅，尹華峰，等.小檗堿對膽固醇代謝及肝臟Insig-2基因表達的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(1):85－8.

［11］Chang W，Wang H，Yin H F，et al.Effects of berberine on cholesterol metabolism and Insig-2 gene expression of hyperlipidemic rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):85 － 8.

［12］羅 映，金 磊，何 琦，等.小檗堿對兔血脂代謝及維生素D受體和胰島素誘導基因2基因表達的影響［J］.中草藥，2011，42(8):1566－70.

［12］Luo Y，Jin L，He Q，et al.Effects of berberine on lipid metabolism and vitamin D receptor as well as insulin-induced gene 2 gene expression of rabbits［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2011，42(8):1566－70.

［13］Ejaz A，Wu D，Kwan P，et al.Curcumin inhibits adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes and angiogenesis and obesity in C57/BL mice［J］.J Nutr，2009，139(5):919 －25.

［14］Fan C，Wo X，Qian Y，et al.Effect of curcumin on the expression of LDL receptor in mouse macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2006，105(1－2):251－4.

［15］Xie X Y，Kong P R，Wu J F，et al.Curcumin attenuates lipolysis stimulated by tumor necrosis factor-αor isoproterenol in 3T3-L1 adipocytes［J］.Phytomedicine，2012，20(1):3 － 8.