解毒通絡(luò)方中三七皂苷類成分腦脊液藥代動(dòng)力學(xué)研究

李 磊，張麗慧，李 智，周曉耘，辛文鋒，張文生

(1.北京師范大學(xué)地表過(guò)程與資源生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京 100875;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京 100029;3.北京師范大學(xué)校醫(yī)院北京 100875;4.中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京 100875)

三七皂苷類成分是中藥三七的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷在心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性［1］，三七皂苷所具有的這些功效使其在治療腦源性疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景。解毒通絡(luò)方是王永炎院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由梔子有效部位、三七總皂苷以及燈盞花有效部位組成，具有祛瘀、清熱、解毒的功效，主要用于治療缺血性中風(fēng)病。本文以人參皂苷Rg1及三七皂苷R1為指標(biāo)成分，采用HPLC-MS/MS法測(cè)定靜脈注射給藥后人參皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠腦脊液的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律，同時(shí)研究解毒通絡(luò)方(Jiedutongluo prescription，JDTL)復(fù)方配伍對(duì)人參皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠腦脊液中分布的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑 三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為:110745-200415、110703-200726);三七總皂苷、解毒通絡(luò)方(北京師范大學(xué)中藥資源與資源藥物研究所提供);甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)。1.2 儀器 Q-TRAP 3200質(zhì)譜儀(Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)Applied Biosystem公司);Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量(220±20)g，清潔級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和動(dòng)物研究所。許可證號(hào) SCXK(京)2005－0013。實(shí)驗(yàn)前禁食過(guò)夜，飲水不限。

2 方法

2.1 給藥與采樣 取大鼠6只，隨機(jī)分成三七總皂苷給藥組和解毒通絡(luò)方給藥組，每組3只。腹腔注射6 ml·kg－1(10 g·L－1)的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剪開大鼠頭頸部背側(cè)皮膚，鈍性剝離覆蓋在枕骨上的肌肉，將連有PE管的針頭刺入枕骨大孔，使腦脊液能順著PE管流出。用膠黏劑以及牙科水泥固定針頭并用夾子夾住PE管尾端。采集樣品時(shí)取下夾子，用微量注射器緩慢抽取，采樣完畢后，再用夾子夾住 PE 管末端［2］。

根據(jù)解毒通絡(luò)方的處方量，按三七總皂苷(PNS)16.8 mg·kg－1(其中三七皂苷 R1的含量為8.4%，人參皂苷 Rg1的含量為21.8%)、解毒通絡(luò)方(JDTL)22.2 mg·kg－1的劑量尾靜脈注射分別給予三七總皂苷生理鹽水溶液和解毒通絡(luò)方生理鹽水溶液，于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)(5、10、20、40、60、90、120、180、240、480 min)采集腦脊液 20 μl，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腦脊液樣品預(yù)處理 取腦脊液樣品15 μl，加入甲醇 45 μl，渦旋振蕩 1 min，離心 10 min(10 000 r·min－1)后取上清液，進(jìn)樣。

2.3 分析方法 液相色譜條件:色譜柱:Symmetry ShieldTMRP18(5 μm，4.6 mm ×150 mm);流動(dòng)相:A為甲醇，B為水，梯度洗脫程序見(jiàn)Tab 1;流速:1.0 ml·min－1;進(jìn)樣量:20 μl;柱溫:25℃ 。

質(zhì)譜條件:掃描方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500 V;檢測(cè)方式:正離子方式，人參皂苷 Rg1［M+Na］+(823.5/643.6)，解簇電壓130 V，碰撞能量50 eV;三七皂苷 R1［M+Na］+(955.3/203.2)，解簇電壓140 V，碰撞能量66 eV。

Tab 1 Gradient program of determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1in rat cerebrospinal fluid by HPLC-MS

2.4 質(zhì)控樣品的制備 取空白腦脊液，加入三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的對(duì)照品溶液，配制成低、中、高3個(gè)濃度的腦脊液樣品(三七皂苷 R1的濃度為25，100，400 μg·L－1;人參皂苷 Rg1的濃度為50，200，800 μg·L－1)，按照“2.2”方法操作后進(jìn)樣。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，置25 ml量瓶中，用甲醇配制成一定濃度的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，臨用時(shí)，用空白腦脊液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的對(duì)照品混合溶液，三七皂苷 R1的濃度分別為 2.5、5、12.5、25、62.5、125、250、500 μg·L－1，人參皂苷 Rg1的濃度分別為5、10、25、50、125、250、500、1 000 μg· L－1。按“2.2”方法操作并進(jìn)樣測(cè)定，以各對(duì)照品色譜峰峰面積 Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X(μg·L－1)為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)(權(quán)重1/X2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸。

2.6 含藥腦脊液樣品測(cè)定 三七總皂苷單獨(dú)給藥組和解毒通絡(luò)方給藥組的大鼠腦脊液樣品的處理方法同“2.2”。樣品測(cè)定方法同“2.3”。

2.7 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DAS 2.0版藥動(dòng)學(xué)軟件擬合計(jì)算各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 在采用的色譜和質(zhì)譜條件下，三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)Fig 1，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Fig 2、3。三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1分離良好，腦脊液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的測(cè)定。

Fig 1 Full-scan mass of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1

Fig 2 MRM of notoginsenoside R1in rat CSF determination by HPLC-MS

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 三七皂苷R1的標(biāo)準(zhǔn)曲線:=153X+157(r=0.998 1，n=8)，線性范圍為2.5 ～500 μg·L－1;人參皂苷 Rg1的標(biāo)準(zhǔn)曲線:=477X+454(r=0.993 4，n=8)，線性范圍為 5～1 000 μg·L－1。三七皂苷 R1和人參皂苷 Rg1最低定量限分別為 2.5、5 μg·L－1。

3.3 精密度試驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品，按“2.2”方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算樣品濃度，測(cè)定日內(nèi)精密度。每個(gè)濃度的樣品連續(xù)3 d，每天進(jìn)樣，測(cè)定日間精密度。測(cè)定結(jié)果三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的日內(nèi)精密度RSD均小于5%、日間精密度RSD均小于12.2%，見(jiàn) Tab 2。

3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度平行操作3份，用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)際濃度，與理論濃度相比得到方法回收率。三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的平均回收率分別為98.0% ～102.7%、93.9% ～101.1%，見(jiàn)Tab 3。

Fig 3 MRM of ginsenoside Rg1in rat CSF determination by HPLC-MS

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

RSD/%Notoginsenoside R1Added/μg·L －1 Intra-day precision Determined/μg·L －1RSD/%Intra-day precision Determined/μg·L－1 25 25.7 ±0.9 3.5 24.0 ±2.0 8.3 100 101.0 ±2.6 2.6 99.1 ±12.1 12.2 400 392.0 ±14.5 3.7 380.0 ±29.6 7.8 Ginsenoside Rg1 50 50.8 ±0.6 1.2 47.8 ±3.8 7.9 200 200.0 ±5.4 2.7 216.0 ±14.9 6.9 800 751.0 ±36.0 4.8 768.0 ±73.0 9.5

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Added/μg·L －1Recovery/% RSD/%Notoginsenoside R1 Recovery Determined/μg·L －1 25 25.7 ±1.7 102.7 ±6.9 6.7 100 98.2 ±6.5 98.2 ±6.5 6.6 400 391.8 ±31.6 98.0 ±7.9 8.1 Ginsenoside Rg1 50 50.6 ±3.2 101.1 ±6.4 6.3 200 190.7 ±6.5 95.3 ±3.3 3.5 800 751.6 ±39.6 93.9 ±5.0 5.3

3.5 實(shí)驗(yàn)組腦脊液樣品中三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1的藥代動(dòng)力學(xué) 大鼠尾靜脈注射三七總皂苷以及解毒通絡(luò)方溶液后，三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1在腦脊液中的分布濃度數(shù)據(jù)見(jiàn)Tab 4、5。腦脊液分布濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)Fig 4、5。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn) Tab 6、7。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中腦脊液樣本的處理非常簡(jiǎn)單，方法回收率較高，而且Q-TRAP 3200型儀器穩(wěn)定性良好，所以選擇外標(biāo)法進(jìn)行定量。

Fig 4 Concentration-time curves of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Fig 5 Concentration-time curves of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 109.4 ±82.2 97.9 ±86.8 10 188.6 ±166.8 196.0 ±139.4 20 161.2 ±82.0 275.3 ±168.4 40 250.9 ±179.0 319.3 ±216.9 60 195.5 ±160.6 265.2 ±191.8 90 149.7 ±115.5 232.1 ±204.9 120 91.6 ±76.2 133.4 ±89.5 180 67.5 ±48.6 87.8 ±39.6 240 30.2 ±15.8 53.0 ±38.7 5 480 10.2 ±4.0 9.7 ±3.7

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 266.3 ±227.4 294.7 ±262.9 10 407.1 ±389.5 526.1 ±418.9 20 367.3 ±212.6 606.3 ±402.1 40 547.0 ±376.7 673.3 ±465.2 60 387.9 ±329.1 553.3 ±434.2 90 286.8 ±231.8 449.0 ±422.0 120 258.3 ±97.2 225.8 ±200.6 180 147.3 ±63.6 107.3 ±80.8 240 88.0 ±47.9 40.8 ±28.0 5 480 15.4 ±7.1 12.6 ±5.1

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.56 ±0.19 0.83 ±0.60 Cmax/μg·L－1 258.17 ±166.83 344.00 ±195.85 AUC0－t/μg·h·L －1 545.13 ±374.02 774.20 ±301.22 AUC0－∞ /μg·h·L－1 586.21 ±358.57 804.47 ±306.20 T 12/h 2.38 ±1.10 1.64 ±0.11 Ke/h －1 0.33 ±0.12 0.42 ±0.03 CL/L·h－1·kg－14.16 ±3.68 2.03 ±0.79

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.94 ±0.95 0.56 ±0.39 Cmax/μg·L－1 610.67 ±273.96 708.00 ±467.12 AUC0－t/μg·h·L －1 1 244.25 ±443.60 1 325.28 ±918.26 AUC0－∞ /μg·h·L－1 1 400.57 ±423.68 1 355.66 ±917.74 T 12/h 1.49 ±0.07 1.72 ±0.49 Ke/h －1 0.47 ±0.02 0.42 ±0.11 CL/L·h－1·kg－13.19 ±1.02 4.62 ±4.29

目前關(guān)于三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的血漿濃度測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其在腦脊液中的分析測(cè)試方法。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS法，建立腦脊液樣品中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的定量分析方法，并研究其在腦脊液中的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠尾靜脈注射三七總皂苷以及解毒通絡(luò)方5～10 min后，即可在腦脊液中檢測(cè)到三七皂苷R1和人參皂苷Rg1，說(shuō)明兩種成分都可以較快進(jìn)入大鼠腦脊液中，而且消除速度也較快，8 h后的腦脊液中的濃度已相對(duì)較低。

中藥在腦源性疾病治療方面具有較好的療效，這與中藥復(fù)方配伍或有效組分配伍應(yīng)用發(fā)揮了多途徑、多靶點(diǎn)的作用有關(guān)。中藥配伍應(yīng)用對(duì)損傷的血腦屏障結(jié)構(gòu)有改善和重建作用，還可通過(guò)影響轉(zhuǎn)運(yùn)體而特異性地影響血腦屏障，從而增加藥物的腦內(nèi)濃度，這可能就是闡明中藥治療腦源性疾病作用途徑和作用機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。因此，從腦脊液藥代動(dòng)力學(xué)角度研究中藥有效組分在透過(guò)血腦屏障時(shí)的協(xié)同配伍作用也成為一個(gè)新的研究方向，相關(guān)研究?jī)?nèi)容已有文獻(xiàn)報(bào)道［4］。從本實(shí)驗(yàn)尾靜脈注射三七總皂苷和解毒通絡(luò)方后三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)看，與三七總皂苷相比，解毒通絡(luò)方中三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有一定的波動(dòng)，但變化不大，說(shuō)明解毒通絡(luò)方復(fù)方配伍對(duì)于三七皂苷R1和人參皂苷 Rg1在腦脊液中的累積沒(méi)有明顯的影響，推測(cè)其可能是通過(guò)其他途徑發(fā)揮配伍作用。

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