經(jīng)牽涉區(qū)皮下局麻藥抑制大鼠子宮炎性痛的實驗研究

張錚錚，陸曉媛，張勵才

(徐州醫(yī)學(xué)院1.附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、2.江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 221002)

內(nèi)臟痛是臨床常見的癥狀之一，特別是中、晚期內(nèi)臟癌癥患者多伴有難以忍受的劇痛，目前仍無確切有效的治療辦法，因此探尋有效治療途徑與方法仍是疼痛研究領(lǐng)域面臨的重要課題。

日常體驗及新近的研究表明，適當(dāng)?shù)挠|摸、按摩、不同頻率的Han’s儀以及經(jīng)皮電刺激(TENS)等可以減輕疼痛［1－3］，這些治療多以經(jīng)絡(luò)或阿是部位為參考。而解剖學(xué)研究表明，許多內(nèi)臟器官及其牽涉區(qū)不在經(jīng)典的經(jīng)絡(luò)通路上，既然內(nèi)臟痛可以導(dǎo)致遠離該器官的體表區(qū)出現(xiàn)牽涉痛，這說明二者之間必然存在某種內(nèi)在的形態(tài)學(xué)聯(lián)系?？煞窭眠@種內(nèi)在聯(lián)系經(jīng)牽涉皮區(qū)施加合適的干預(yù)因素抑制內(nèi)臟痛?迄今尚未見有類似的臨床實踐與基礎(chǔ)研究。我們前期的研究表明，預(yù)先在牽涉區(qū)皮下注射利多卡因，可以明顯減少膀胱傷害性刺激引起的L6～S1脊髓背角Fos陽性細胞的數(shù)量［4］，初步提示上述設(shè)想可能具有一定的可行性，但不同內(nèi)臟器官及其牽涉痛是否具有同樣的規(guī)律仍需進一步深入研究。

子宮痛(包括子宮癌痛)是婦科常見的臨床疼痛之一，給無數(shù)婦女造成嚴(yán)重的身心痛苦，目前同樣缺乏有效的治療措施，可否經(jīng)其牽涉區(qū)抑制其疼痛，值得探討。鑒于直接進行人體試驗存在倫理學(xué)的限制，而人類與動物的牽涉區(qū)也因發(fā)育的差異不能完全套用，因此如何重新確認動物子宮痛的“牽涉區(qū)”是首先需要解決的關(guān)鍵問題。1997年，Wesslmann預(yù)先經(jīng)頸內(nèi)靜脈向循環(huán)系統(tǒng)注入伊文思藍(Evans blue)，然后用芥子油注入大鼠子宮腔制作子宮炎性痛，結(jié)果在動物出現(xiàn)子宮炎性痛的同時，其特定體表區(qū)(下腹部近恥骨聯(lián)合處)恒定出現(xiàn)Evans blue滲漏斑［5］。該實驗幾近模擬了人類牽涉痛現(xiàn)象，客觀地顯示了動物內(nèi)臟痛與牽涉區(qū)的關(guān)系，因此較好地解決了動物無法自述其內(nèi)臟痛牽涉區(qū)的難題。

藉此，本實驗擬以Formalin注入子宮制作炎性痛，經(jīng)其牽涉皮區(qū)施加局麻藥，以通用的內(nèi)臟痛評分法［6］作為整體痛行為定量指標(biāo)，以公認的與痛程度呈正相關(guān)的c-fos原癌基因的表達蛋白Fos在相關(guān)脊髓節(jié)段的表達量作為分子物質(zhì)的觀測指標(biāo)［8］，探討經(jīng)牽涉皮區(qū)抑制子宮痛的可行性，以期為臨床治療內(nèi)臟痛提供新的途徑與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 未孕♀ Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物置于安靜、溫暖、避強光環(huán)境內(nèi)正常喂養(yǎng)72 h以上。隨機分為4組(n=6):A組(單純子宮炎性痛模型組)，乙醚麻醉下，生理鹽水沖洗大鼠陰道，用自制陰道窺器，在目視下將人用硬膜外導(dǎo)管植入子宮腔，深度距陰道外口約4 cm，導(dǎo)入5%Formalin 1.0 ml，留置5 s，不做任何鎮(zhèn)痛處理;B組(非牽涉皮區(qū)鎮(zhèn)痛組)，以A組相同方法制作子宮炎性痛模型后，在遠離牽涉區(qū)的頸后部皮下注射0.5%的利多卡因0.3 ml作鎮(zhèn)痛處理;C組(牽涉皮區(qū)局麻藥鎮(zhèn)痛組)，以B組相同方法制作子宮炎性痛模型后，在牽涉區(qū)(恥骨聯(lián)合上緣)皮下給予0.5%的利多卡因0.3 ml，實施牽涉區(qū)局部鎮(zhèn)痛;D組(正常對照組)，動物常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.2 行為學(xué)評分 各組大鼠在麻醉蘇醒，出現(xiàn)翻正反射1 min后，進行疼痛學(xué)評分(S)，評分規(guī)則如下:①舔腹部或外陰區(qū)為L;②肢體伸展，如伸后肢為B;③軀干扭曲為C;④全身收縮，偶伴痙攣為W，收縮持續(xù)時間不足30 s為W1，痙攣在30 s和60 s之間為W2，痙攣多于60 s為W3。計數(shù)每15 min內(nèi)上述4種行為出現(xiàn)的次數(shù)，按照公式:S=1L+2B+3C+4W1+5W2+6W3進行疼痛學(xué)評分。每15 min為1次，間隔15 min，共3次，持續(xù)時間為1.5 h。

1.3 組織制備 各組動物在痛行為學(xué)評分觀測完畢后，水合氯醛麻醉，經(jīng)升主動脈先快速灌注150 ml生理鹽水，再灌注300 ml 4%多聚甲醛溶液(用0.1 mol·L－1PB配制)，先快后慢，約在2 h內(nèi)完成。灌注后打開椎板暴露脊髓，取出與支配子宮交感神經(jīng)相關(guān)脊髓節(jié)段(T10－L1)。在上述相同灌注液中繼續(xù)固定(4℃，4～6 h)，5% ～30%的蔗糖磷酸緩沖溶液梯度脫水，直至組織塊下沉。將脊髓組織作連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm，行Fos免疫組化反應(yīng)。

1.4 Fos免疫組化反應(yīng)與計數(shù) 切片在溫室下依次入:(1)兔抗血清(1∶2 000，Cambridge Research Biochemical)，孵育過夜;(2)結(jié)合生物素的羊抗兔IgG(Vetor，1 ∶200)孵育2 h;(3)ABC 復(fù)合物(Vector，1∶200)孵育1 h。其中，一抗和二抗用含0.3%Triton X-100、0.2%馬血清和0.03%NaN3的PBS稀釋。最后切片在含0.05%DAB、0.005%硫酸鎳銨和0.003%H2O2的Tris-HCI緩沖液(pH 7.6)內(nèi)呈色20～30 min。將切片裱于涂有明膠的載片上，經(jīng)干燥、脫水、透明后，DPX封片。顯微鏡觀察、攝像Fos免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元。選取Fos表達最集中分布區(qū)固定序列切片5張，用Image-Pro Plus Version 6.0 圖像分析軟件(Media Cybernetics，Bethesda，USA)，統(tǒng)一在放大100倍條件下，進行Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組動物的痛行為評分 動物在麻醉蘇醒出現(xiàn)翻正反射1 min后，根據(jù)Miampamba M法分0～15 min，31～45 min，61～75 min 3個時間段，評分并記錄其內(nèi)臟痛行為表現(xiàn):子宮炎痛行為主要出現(xiàn)在動物麻醉蘇醒出現(xiàn)翻正反射后的前0～15 min時間段內(nèi)，其中A(子宮痛模型)組和B(非牽涉區(qū)鎮(zhèn)痛組)內(nèi)臟痛評分明顯增加;C(牽涉區(qū)鎮(zhèn)痛)組較A，B內(nèi)臟痛評分降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而在第31～45 min和第61～75 min兩個時間段，A、B、C各組內(nèi)臟痛評分普遍下降，趨緩。組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。D(正常對照)組，偶見舔腹部或外陰區(qū)(L)行為，未見 B(伸展)、C(扭曲)、W(痙攣)等行為學(xué)表現(xiàn)，各時間段差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。如Fig 1所示。

2.2 各組動物脊髓相關(guān)節(jié)段的Fos表達 不予鎮(zhèn)痛的模型(A)組計數(shù)為192.00±7.62;經(jīng)非牽涉皮區(qū)鎮(zhèn)痛(B)組為190.67±7.56;經(jīng)牽涉皮區(qū)鎮(zhèn)痛(C)組為54.83±4.45;正常對照(D)組偶見Fos表達，未作計數(shù)。C組與A、B組相比，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A、B兩組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組動物脊髓相關(guān)節(jié)段的Fos表達的形態(tài)學(xué)證據(jù)見Fig 2。

Fig 1 Score of visceralgia in every group

3 討論

以動物子宮痛條件下Evans blue滲漏斑出現(xiàn)部位作為子宮痛的牽涉區(qū)僅見Wesslmann報道，其他內(nèi)臟器官痛是否具有同樣的現(xiàn)象尚無先例。我們通過復(fù)制或模擬Wesslmann的方法，先后觀察了大鼠子宮、膀胱［4］、膽囊［7］、胃［8］等不同內(nèi)臟器官疼痛的牽涉區(qū)，進一步證實以該方法具有普遍的操作性。但應(yīng)該指出的是，以此法得出的某些內(nèi)臟器官的牽涉區(qū)與既往記載的人類牽涉區(qū)部位略有不同，這可能是由于動物與人類胚胎體節(jié)生長發(fā)育差異所致。

內(nèi)臟痛的發(fā)生機制極其復(fù)雜，研究頗多。新近的研究表明，提高雌激素水平可加重內(nèi)臟痛反應(yīng)［9］，福爾馬林所致的外周炎性痛可誘導(dǎo)脊髓水平的Fos和前強啡肽蛋白表達增加［11］，加巴噴丁對大鼠直腸乙狀結(jié)腸炎性痛具有鎮(zhèn)痛作用［10］。而福爾馬林所致的子宮炎性痛可否誘導(dǎo)相關(guān)脊髓水平的Fos表達變化?經(jīng)牽涉區(qū)給予局麻藥物利多卡因抑制子宮炎性痛尚待證實。本研究基于Wesslmann實驗提供的子宮痛牽涉區(qū)，觀測了經(jīng)牽涉區(qū)給予局麻藥利多卡因?qū)ψ訉m炎性痛行為及相關(guān)脊髓節(jié)段Fos蛋白的影響。結(jié)果表明Formalin誘導(dǎo)子宮炎痛行為主要在動物麻醉蘇醒出現(xiàn)翻正反射后的前0～15 min時間段內(nèi)評分明顯升高，提示痛反應(yīng)劇烈。而在第31～45 min和第61～75 min兩個時間段，內(nèi)臟痛評分明顯下降，痛反應(yīng)趨于平緩并減輕。上述結(jié)果提示Formalin誘導(dǎo)的子宮(內(nèi)臟)痛與外周(軀體)痛在行為學(xué)反應(yīng)時相上可能存在異同［12］。即子宮痛的第一時間段(0～15 min)與Formalin誘導(dǎo)的軀體痛的第一時相持續(xù)時間與強度近似，而其后的31～75 min時間段的子宮痛程度與Formalin誘導(dǎo)軀體痛的第二時相相比緩解更快，更明顯，確切原因尚待進一步探討。

我們的實驗表明，經(jīng)牽涉皮區(qū)給予局麻藥物可以明顯降低炎性子宮痛的行為學(xué)評分，且與之相關(guān)脊髓節(jié)段的Fos表達量也減少，因此從整體行為與物質(zhì)分子兩個層面提示經(jīng)牽涉皮區(qū)施加合適的鎮(zhèn)痛措施有可能緩解內(nèi)臟痛，為臨床內(nèi)臟痛的治療提供了新的途徑及其實驗依據(jù)。

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