2-APB對自發(fā)性高血壓大鼠腦微動脈平滑肌細胞縫隙連接的影響

王洋，馬克濤，張雯，李 麗，趙磊，魏麗麗，司軍強

（石河子大學醫(yī)學院生理學教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子 832002）

血管平滑肌細胞在成年個體是一種高度特化的細胞，具有收縮、調節(jié)血管張力和維持血壓等功能[1]。血管緊張度的增加是高血壓發(fā)病的關鍵，而血管平滑肌舒縮是依賴細胞間的信號物質進行調節(jié)的。由縫隙連接蛋白構成的細胞間直接通訊，縫隙連接在調節(jié)血管同步舒縮、血管平滑肌細胞增殖、平滑肌表型轉變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關[2-4]。

Mao等[5]發(fā)現(xiàn)應用縫隙連接阻斷劑庚醇通過阻斷心肌細胞間的縫隙連接通訊，可起到對心肌的保護作用。Loewnestein等[6]發(fā)現(xiàn)細胞間傳導可由離子及代謝物調節(jié)，并提出Ca2+對細胞間的縫隙連接有調節(jié)作用，即在縫隙連接電導的調節(jié)中，Ca2+起著關鍵性作用。而鈣釋放激活鈣通道抑制劑2-氨基乙基二 苯 硼 酸 酯 （2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）[7]已被證實可以抑制大鼠血管平滑肌細胞在血清刺激下發(fā)生表型轉換與增殖，是潛在的抗血管增殖的藥物，我們探討作為非選擇性的縫隙連接阻斷劑，2-APB是否能夠對高血壓微動脈起到一定的保護作用。因此，本實驗在急性分離正常血壓Wistar大鼠 (Wistar Rat,WR)和自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat,SHR）腦微動脈標本上應用全細胞膜片鉗技術，觀察2-APB對SHR腦腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接的影響，初步探討縫隙連接與原發(fā)性高血壓疾病及2-APB可能為高血壓疾病臨床治療提供更多的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇20周齡雄性SHR及正常血壓WR，分別購自北京維通利華實驗動物有限責任公司（許可證編號SCXK京2007-0001）和新疆醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證編號SCXK新2003-0001）。

1.2 主要試劑、儀器和溶液

2-氨基乙基二苯硼酸酯 （2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）、木瓜蛋白酶（Papain）、膠原酶 IA（Collagenase IA）、BSA、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、多聚賴氨酸均由 Sigma公司提供，其余試劑均為國產分析純試劑。

BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀 （四川成都泰盟公司），Axon 700 B放大器（美國Axon公司），P-97拉制儀（美國Sutter公司）等。

生理鹽緩沖溶液中 （mmol/L）：NaCl 138.0，KCl 5.0，CaCl21.6，MgCl21.2，Na-HEPES 5.0，HEPES 6.0，Glucose 7.5。細胞分離液成分為（mmol/L）：NaCl 142，KCl5，CaCl20.05，MgCl21，Na-HEPES 4，HEPES 5，Glucose 7.5。 電極內液成分是（mmol/L）：K-gluconate 130，NaCl 10，CaCl22.0，MgCl21.2，HEPES 10，EGTA 5，Glucose 7.5。

1.3 方法

1.3.1大鼠無創(chuàng)尾動脈血壓測定

大鼠于40℃預熱適應15 min后，用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀測量大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動脈的血壓以測量3次后平均值為大鼠收縮壓。

1.3.2大鼠腦微動脈段的分離及動脈平滑肌細胞的制備[8]

將大鼠在麻醉狀況下放血處死，迅速取出大腦，置于在生理鹽溶液中，迅速分離出腦動脈及其分支。

腦微動脈段標本制備：將截取好的腦微動脈段（直徑＜100 μm）標本置于培養(yǎng)皿中，一端固定在多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿底部，在37℃溫箱中用含有膠原酶IA（1.5 mg/mL）的生理鹽溶液處理15-16 min，生理鹽溶液置換2次去除殘存酶液，使用顯微鑷在解剖鏡下進一步去除其外層結締組織。將處理好的標本用鉑金片固定于培養(yǎng)皿中央后轉移至光學顯微鏡下進行全細胞膜片鉗實驗。

單個平滑肌細胞制備：將腦微動脈置于細胞分離液中20 min，將腦微動脈剪成幾段放入消化液后，在37℃溫箱中消化10-15 min，消化液成分包括（mg/mL）：Papain 0.75，Collagenase IA 1，BSA 3.75，DTT 0.3。1000 r/min離心6 min后棄上清液，加入細胞分離液制成細胞懸浮液，如此反復替換3次后，將液體移至清潔、干燥的培養(yǎng)皿內，靜置15-20 min使細胞貼壁[8]。

1.3.3全細胞膜片鉗記錄[9-10]

在22～25℃條件下給予標本持續(xù)灌注生理鹽溶液（0.2 mL/min）進行全細胞膜片鉗實驗。記錄電極阻抗為5～8 MΩ，通過微操縱器接觸到細胞后給予負壓形成GΩ高阻封接，膜電流用10 kHz（-3 dB）低頻濾過。

生物電信號通過PC計算機記錄，鉗制電壓為-40 mV，從-140 mV至+60 mV給予去極化脈沖刺激，階躍為20 mV。細胞膜電容通過公式C=Q/V獲得，電極電阻（Ra）引起的實際鉗制電壓（Vm）與命令電壓（Vc）誤差通過公式：Vm=Vc-I×Ra 進行補償。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 SHR和WR尾動脈血壓

SHR 的收縮壓為（217.7±9.6）mmHg（n=8），明顯高于正常 WR 的收縮壓（123.2±0.6）mmHg（n=8）（P＜0.01）。

2.2 SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接耦聯(lián)力增強

WR和SHR腦微動脈平滑肌細胞膜電導分別是（3.76±0.31）nS 和（6.89±0.90）nS，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 細胞膜電阻分別是（269±37）MΩ 和（126±26）MΩ 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞膜電容分別是（81±18）pF 和（168±44）pF，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 2-APB對腦微動脈段上平滑肌細胞膜電生理特性的影響Tab.1 Influence of 2-APB on the membrane properties of smooth muscle cells in cerebral arteriolar in wholecell confguration

2.3 2-APB抑制WR和SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接

2-APB對WR和SHR腦微動脈段上平滑肌細胞 Rinput、Ginput和 Cinput的影響， 結果發(fā)現(xiàn)應用 100 μmol/L 2-APB 后細胞的 Rinput、Ginput和 Cinput與單個平滑肌細胞數值十分接近（表1）。此外，對正常WR和SHR細胞膜電容充放電用單指數方程分別進行擬合（圖1A和B中虛線部分），應用2-APB前擬合效果較差（r≤0.90），給予 100 μmol/L 2-APB 后擬合效果很好（r＞0.96），且細胞 Cinput的充放電的時間也顯著降低。

圖1 2-APB抑制WR和SHR平滑肌細胞間縫隙連接Fig.1 2-APB inhibits the gap junctions between the smooth muscle cells of WR and SHR

WR和SHR腦微動脈平滑肌細胞膜電位分別是（-39.18±4.03）mV 和（-40.45±3.59）mV，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05，n=12）。 應用ramp刺激發(fā)現(xiàn)，2-APB凈電流 I/V曲線幾乎是線性 （圖2），且2-APB凈電流翻轉電位點與腦微動脈段上平滑肌細胞靜息膜電位 （-40～-60 mV）十分接近。提示2-APB主要抑制腦微動脈平滑肌細胞間的縫隙連接，減少細胞的Ginput。

圖2 2-APB凈電流的I/V曲線Fig.2 2-APB induces net current I-V curves

2-APB對WR和SHR腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接的抑制具有濃度依賴性（圖3），0.001～100 μmol/L的2-APB可以濃度依賴的抑制腦微動脈平滑肌細胞Ginput（n=6）。2-APB抑制WR和SHR腦微動脈段上平滑肌細胞Ginput的IC50分別為0.21 μmol/L和0.83 μmol/L，兩組腦微動脈間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 2-APB濃度依賴的抑制WR和SHR平滑肌細胞Fig.3 Concentration-dependent inhibition by 2-APB on the membrane input conductance（Ginpt）of the smooth muscle cells in WR and SHR

3 討論

眾所周知，哺乳動物的縫隙連接通道由一個十分相近的基因家族所編碼，1個縫隙連接通道由2個頭一頭相接的半通道連接子共同圍成的一個水相通道。親水通道的膜電位下降、pH值變小或胞液內游離Ca2+濃度升高均可改變縫隙連接蛋白的構象而使其管腔變小甚至關閉，這在生物學上可能起保護作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除血管內皮細胞連接蛋白43和連接蛋白40基因后，小鼠出現(xiàn)高血壓和心肌肥厚[12]。在高血壓疾病狀態(tài)下，大鼠腸系膜動脈、尾動脈、大腦中動脈及先兆子癇患者視網膜動脈等阻力血管舒縮的振幅較正常血壓者顯著升高[13-14]，其可能的意義是SHR通過提高血管平滑肌細胞間的電化學信息傳遞，保證血管舒縮的同步性。Azzam[2]等也證實縫隙連接在調節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細胞增殖和平滑肌的表型轉變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關。

腦動脈血管上縫隙連接通道廣泛分部于平滑肌細胞間、內皮細胞間以及平滑肌細胞和內皮細胞間[13]，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在腸系膜動脈三級分支預灌流2-APB 100 μmol/L后使KCl和PE引起的血管收縮均顯著降低，其中SHR降低幅度更加顯著[15]；本實驗發(fā)現(xiàn)2-APB能夠濃度依賴性的抑制腦微動脈平滑肌細胞間縫隙連接，且抑制WR和SHR腦微動脈段上平滑肌細胞Ginput的IC50分別為0.21 μmol/L和0.83 μmol/L，兩組腦微動脈間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結果提示：一定濃度的2-APB可能通過降低SHR大鼠血管平滑肌細胞間縫隙連接通訊對SHR阻力血管舒縮起到一定的保護作用，其具體機制還有待進一步研究。

目前，一方面，2-APB能夠非選擇性地抑制血管平滑肌細胞間的縫隙連接[7,15]；另一方面，對于2-APB的作用研究的最多的也是最可靠的，就是它能夠通過調節(jié)鈣釋放激活鈣通道的活性，其作用是雙向的，即低濃度促進、高濃度抑制鈣釋放激活鈣通道電流，可以有效抑制血管平滑肌細胞的表性轉換和增殖[7]，與Azzam[2]的結果一致，以上結果均提示2-APB通過抑制平滑肌細胞表型的轉換和增殖影響高血壓的發(fā)生過程。此外，Ca2+對細胞間的縫隙連接有調節(jié)作用，即在縫隙連接電導的調節(jié)中，Ca2+起著關鍵性作用[15]，而2-APB能夠通過調節(jié)鈣釋放激活鈣通道的活性而影響鈣池操縱的Ca2+內流。本研究在急性分離的兩組大鼠腦微動脈上，應用2-APB濃度≥100 μmol/L(抑制鈣釋放激活鈣通道電流)時可以完全阻斷WR和SHR腦微動脈平滑肌細胞間的縫隙連接；且2-APB對SHR腦微動脈段上平滑肌細胞Ginput的IC50高于WR，提示2-APB可以通過抑制縫隙連接電化學通訊減少傷害性刺激的信號傳遞。

總之，本研究中我們應用膜片鉗技術對2-APB作用于SHR腦微動脈平滑肌間縫隙連接的影響做了初步研究，提示SHR較WR腦動脈平滑肌細胞間的縫隙連接的表達或功能增強，促使縫隙連接耦聯(lián)力增強，保持了血管舒縮的同步性；對于2-APB抑制SHR腦微動脈平滑肌細胞的增殖，這對了解2-APB對高血壓的調節(jié)機制，以及其在潛在的治療作用中具有重要的意義，可能為臨床能治療高血壓提供更多的思路。

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