胃癌小鼠模型中T淋巴細胞檢測及初步分析

王錦國,吳向未,陳雪玲,李維嘉,牛建華

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，石河子832000）

胃癌是一種最常見的惡性腫瘤，在全世界癌癥中占8%的總病例和10%的總死亡人數(shù)[1]。在中國，日本，韓國等許多亞洲國家，它仍然是癌癥相關(guān)死亡的常見原因之一。胃癌被診斷出來時，往往已經(jīng)是進展期并且無法手術(shù)治療，放射治療或化療效果并不令人滿意，開發(fā)新的輔助治療方式是必要的，免疫療法有望成為一個新的選擇。因此，在胃癌小鼠模型中觀察免疫系統(tǒng)的作用機制是必不可少的。

機體的免疫系統(tǒng)在抗感染、抗腫瘤等免疫應(yīng)答方面起著重要作用，機體抗腫瘤反應(yīng)主要通過T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫[2]。CD4+T細胞是T淋巴細胞的重要亞群之一，根據(jù)其分泌的細胞因子和介導(dǎo)的功能不同分為Th1和Th2細胞。目前研究認為Th1和Th2等細胞因子以及Th1/Th2比值平衡變化在機體抗腫瘤免疫中起到重要作用[3]。調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell,Treg）是不同于Th1和 Th2的新型T細胞亞群，在不同的研究報道中，還存在爭議，例如一些研究認為Treg細胞具有保護性，而在腫瘤浸潤或外周血中Treg細胞具有抑制效應(yīng)T細胞的作用，從而促進腫瘤細胞的發(fā)展[4]。

本研究通過建立胃癌小鼠模型，流式細胞儀檢測CD4+T/CD8+T細胞比例及Treg細胞標(biāo)記CD4+CD25+T細胞含量的水平變化，探討Treg細胞及T細胞亞群在胃癌模型中的作用，為腫瘤的免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

615近交系小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所，6-8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量20～25g,無特定病原體（SPF）級。

1.1.2主要試劑和儀器

1）RPMI-1640 培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）均購自HYCLIONE 公司；2）流式抗體 CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC、CD25-APC 購 自 ebioscience 公 司 ；3）MFC小鼠胃癌細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1動物模型的建立

用615近交系小鼠，飼養(yǎng)在清潔級動物房，自由光照。MFC胃癌細胞株在含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，放于37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行體外傳代。經(jīng)4%胎盤藍染色確定活細胞數(shù)占細胞總數(shù)的96%以上。MFC細胞計數(shù)后,按1×107個細胞/小鼠注入615小鼠頸背部皮下。接種后小鼠每日正常進食、進水。

1.2.2實驗分組

分別取正常小鼠脾臟及建模成功后1周小鼠的脾臟，檢測T淋巴細胞亞群及Treg細胞水平，每組20只。

1.2.3小鼠脾臟細胞分離[5]

脫頸處死小鼠，浸入75%乙醇內(nèi)3 min，無菌摘取小鼠脾臟，去除與其相連的結(jié)締組織，放入含PBS的小皿中沖洗3次，用無菌注射器的針芯研磨之后用濾網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，將其輕輕加到底部含有淋巴細胞分離液的離心管中離心(2000 r/min,20 min)。收集白膜層,并用PBS洗2次,最后用PBS稀釋成1×107/mL濃度的細胞懸液，備用。

1.2.4流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群及Treg細胞數(shù)量

制備好的脾細胞懸液0.1 mL，分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC熒光素標(biāo)記抗鼠單克隆抗體各20 μL；另取制備好的脾細胞懸液0.1 mL，加入 CD3-FITC、CD4-PE、CD25-APC 熒光素標(biāo)記抗鼠單克隆抗體各20 μL，充分混勻，避光放置30 min，加入0.5 mLPBS上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用X+S表示。兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠皮下移植瘤生長情況

將MFC胃癌細胞種植于小鼠頸背部皮下,所有小鼠在1周左右均可成瘤，腫瘤直徑1 cm左右（圖1）。

圖1 荷瘤小鼠模型Fig.1 Model of tumor-bearing mouse

2.2 CD4+CD25+Treg細胞流式分析結(jié)果

胃癌實驗組小鼠脾CD4+CD25+Treg細胞較正常對照組增多（P＜0.01）（表 1、圖 2）。

圖2 正常對照組及胃癌小鼠脾臟中CD4+CD25+T細胞比例變化的流式細胞分析結(jié)果Fig.2 Variation of the CD4+CD25+T cells proportion from normal control group and gastric cancer group in mice spleen by flow cytometry analysis

2.3 T細胞亞群及CD4+T/CD8+T細胞比值流式分析結(jié)果

胃癌實驗組小鼠脾CD3+T、CD8+T細胞較正常對照組升高；CD4+T細胞及CD4+T/CD8+T細胞比值較正常對照組降低，（P＜0.01）（表 1，圖 3）。

圖3 正常對照組及胃癌小鼠脾臟中CD4+T與CD8+T細胞比例變化的流式細胞分析結(jié)果Fig.3 Variation of the CD4+T and CD8+T cells proportion from normal control group and gastric cancer group in mice spleen by flow cytometry analysis

表1 胃癌組與對照組CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+Treg和CD4+T/CD8+T比值水平檢測結(jié)果 X+S，%Tab.1 Results of CD3+T,CD4+T,CD8+T,CD4+CD25+Treg levels and CD4+T/CD8+T ratio from gastric cancer group and normal control group X+S，%

3 討論

腫瘤的發(fā)生與機體抗腫瘤免疫和免疫狀態(tài)密切相關(guān)。腫瘤免疫主要是通過細胞免疫，細胞免疫是由T淋巴細胞所介導(dǎo)的免疫。T淋巴細胞亞群的相對分布決定了T淋巴細胞的功能狀態(tài)，其調(diào)節(jié)作用通過功能各異的亞群來完成。T細胞的功能和數(shù)量異?？墒鼓[瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視。根據(jù)T淋巴細胞表面分化抗原的差異，可以將成熟的T淋巴細胞分為CD4+T細胞和CD8+T細胞兩大亞群，CD3+T代表全部的T淋巴細胞，CD4+T細胞通過分泌細胞因子，輔助其他免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用；CD8+T細胞具有免疫殺傷效應(yīng),可以特異性識別抗原,直接、連續(xù)與特異性地殺傷靶細胞。但是在免疫應(yīng)答中,效應(yīng)性CD8+T細胞無限制的擴增,則引發(fā)CD8+T細胞通過自身及抑制因子在免疫反應(yīng)中的負向作用，抑制抗體生成及細胞免疫應(yīng)答。CD4+T/CD8+T比值在機體內(nèi)的動態(tài)平衡，是保持機體細胞免疫水平高低的重要調(diào)節(jié)。測定CD4+T,CD8+T及CD4+T/CD8+T比值，能夠直接反映機體的細胞免疫功能水平。有研究表明T淋巴細胞功能與胃癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，尤其CD4+T/CD8+T比值更能反應(yīng)機體的細胞免疫狀態(tài)和抗腫瘤能力[6]。

童明宏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血中CD3+T、CD4+T細胞比值均明顯低于正常人，CD8+T細胞升高，說明胃癌患者免疫功能低下。我們的研究結(jié)果與之相似，胃癌小鼠脾臟中CD4+T細胞較正常小鼠下降，表明在胃癌小鼠體內(nèi)腫瘤細胞可能對CD4+T的功能產(chǎn)生抑制并同時減少其數(shù)量，從而使機體發(fā)生腫瘤免疫耐受，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供良好的免疫環(huán)境。CD3+T細胞及CD8+T細胞數(shù)量有所上升，這可能是由于機體荷瘤以后腫瘤產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致免疫細胞增殖。

劉瑞等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T/CD8+T比值在腫瘤患者中明顯降低。我們的研究結(jié)果與之相符，提示機體在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細胞可能產(chǎn)生免疫抑制因子，使CD4+T細胞功能下降，CD8+T細胞數(shù)量及活性提高，而CD8+T細胞又阻止CD4+T細胞的形成和成熟，使CD4+T細胞數(shù)量降低，表現(xiàn)為CD4+T/CD8+T比值下降，從而使機體免疫功能抑制。

CD4+CD25+T（Treg）細胞在腫瘤發(fā)生和腫瘤細胞免疫逃逸中的作用越來越受到人們的關(guān)注[9]。Treg細胞由Sakaguchi等[10]于1995年首先報道，是一種不同于Th1和Th2的具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群，約占CD4+T細胞的5%-15%。Treg細胞具有“低反應(yīng)性與免疫抑制性”兩大功能特征，活化以后能夠抑制CD+4和CD+8T細胞的活化和增殖作用，并且這種免疫抑制不受主要組織抗原復(fù)合物（MHC）限制[11]，其在腫瘤逃逸宿主免疫攻擊中發(fā)揮重要作用[12]。國外研究發(fā)現(xiàn)在胃癌環(huán)境中Treg細胞數(shù)量升高，抑制了免疫應(yīng)答[13]。我們研究結(jié)果表明Treg細胞在胃癌小鼠脾臟中較正常對照組增高，提示胃癌小鼠免疫功能抑制與Treg細胞的增加有關(guān)，這與Sasada等[14]在149例胃癌患者中檢測結(jié)果一致?？梢哉J為Treg細胞的增加導(dǎo)致機體的免疫調(diào)節(jié)和監(jiān)視功能減弱，腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的清除并可能導(dǎo)致不良預(yù)后。

本研究結(jié)果提示腫瘤患者免疫功能下降，抗腫瘤能力減弱，可以通過提高CD3+T、CD4+T細胞的數(shù)量來提高腫瘤患者的免疫功能。同時通過檢測T淋巴細胞，有助于監(jiān)測機體的免疫狀態(tài)及免疫功能，對評估和判斷預(yù)后都有一定的指導(dǎo)意義。腫瘤環(huán)境中Treg細胞比例增加，導(dǎo)致腫瘤免疫功能失調(diào)，而高水平的Treg細胞可能對具有免疫活性的細胞產(chǎn)生抑制，去除這種細胞可有效誘導(dǎo)腫瘤免疫，這為腫瘤的免疫治療提供一個新的思路。有研究表明Treg細胞可通過表面膜分子接觸和分泌抑制性因子IL-10和TGF-β等方式，抑制體內(nèi)T淋巴細胞及NK細胞等免疫細胞的活性和增殖[15]。具體通過何種方式進行免疫調(diào)節(jié)，還有待進一步研究。

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