豚鼠心肌組織Cav1.2鈣通道蛋白的提取與純化

封 瑞，于麗鳳，胡慧媛，郭 鳳，龜山正樹，郝麗英

L型鈣通道是電壓依賴型鈣通道，其由4個亞單位組成，分別為 α1、α2δ、β1－4和 γ，其中 α1亞單位決定了通道的大部分功能［1］。編碼 α1亞單位蛋白的基因分別為 α1S、α1C、α1D和 α1F，對應(yīng)命名為 Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4。L 型鈣通道廣泛存在于各種細胞中，特別是心肌和心血管平滑肌細胞中，心肌L型鈣通道主要為Cav1.2鈣通道。L型鈣通道是細胞興奮時外鈣內(nèi)流的最主要途徑，其在許多生理和病理情況下起到非常重要的作用，例如在肌肉收縮、激素或神經(jīng)遞質(zhì)分泌，以及在基因表達方面都具有關(guān)鍵作用［2］。

近年來，關(guān)于L型鈣通道功能和結(jié)構(gòu)的研究越來越深入，研究手段也越來越多，如應(yīng)用電生理的方法檢測L型鈣通道電流的變化［3］，采用共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣的變化間接反映L型鈣通道的功能等。除此之外，分子生物學(xué)的方法也得到了廣泛應(yīng)用，例如采用免疫印跡的方法檢測鈣通道蛋白的表達情況［4］，免疫共沉淀的方法檢測鈣通道蛋白與某些特定蛋白的結(jié)合作用情況［5］，以及Pull-down assay的方法檢測鈣通道片段與某些蛋白的結(jié)合情況［6］。然而，研究者們發(fā)現(xiàn)L型鈣通道蛋白作為細胞的膜蛋白，在提取和制備方面仍然存在一定困難。利用傳統(tǒng)的提取總蛋白的方法獲得的L型鈣通道蛋白的量較少，且純度不高，在需要增溶的鈣通道蛋白的研究中，提取總蛋白的方法也無法滿足進一步的實驗，給深入的實驗研究帶來了不同程度的困難。小麥胚芽凝集素(wheat germ lectin-agarose，WGA)能與L型鈣通道蛋白上的膜糖蛋白特異性結(jié)合，因此，本研究采用WGA親和層析的方法制備與純化豚鼠心肌Cav1.2鈣通道蛋白，并用免疫印跡的方法對純化的鈣通道蛋白進行鑒定。以期尋找到制備與純化全長的心肌Cav1.2鈣通道蛋白的方法，為心肌Cav1.2鈣通道蛋白的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 豚鼠，♂♀不限，體質(zhì)量300～400 g，由日本鹿兒島大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 膠原酶，日本Yakult公司;Protease inhibitor cocktail，Roche Diagnostics GmbH，德國;CHAPS，Sigma 公司;抗Cav1.2抗體，抗 N末端1－46氨基酸，Alomone Labs公司;抗Cav1.2抗體，抗C末端1507－1733氨基酸，Stress-Marq Biosciences Inc公司;小麥胚芽凝集素(WGA)，日本W(wǎng)ako公司;ECL發(fā)光試劑盒，GE Health-care公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超高速離心機，日本佐久間制造所;小型動物呼吸機，日本SETA GAYA.KU公司;勻漿儀，日本IUCHI株式會社;Western blot電泳槽和轉(zhuǎn)印槽，美國 Bio-Rad;凝膠自動成像儀，韓國DAHAN公司;圖像分析系統(tǒng)，日本ALTO公司。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室肌組織的制備 豚鼠，體質(zhì)量300～400 g。1%戊巴比妥鈉按100 mg·kg－1行腹腔注射麻醉，氣管插管后，在人工呼吸機支持下開胸進行主動脈管插管，迅速取出心臟，將心臟離體并連接于Langendorff灌流裝置上，37℃恒溫及供氧條件下臺氏液連續(xù)灌流約3 min，無鈣臺氏液灌流約6 min，用含0.05%膠原酶的無鈣臺氏液灌流至心室肌組織被消化;KB液灌流沖洗，剪碎心室肌組織，存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豚鼠心室肌Cav1.2鈣通道蛋白的提取 豚鼠心室肌組織在蛋白裂解液中剪成小塊，然后研磨法勻漿，勻漿后12 000 ×g 離心，20 min，取上清，45 000 r·min－1離心，1 h，沉淀用 Tris緩沖液(100 mmol·L－1Sucrose，20 mmol·L－1Tris-HCl，10 mmol·L－1EGTA，5 mmol·L－1EDTA)重懸，此懸浮液體與WGA孵育2 h，然后用Tris緩沖液洗兩次，所有操作均在冰上進行。將提純的 Cav1.2鈣通道蛋白應(yīng)用Bradford方法檢測蛋白濃度。牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Cav1.2鈣通道蛋白 制備濃度為5.8%的SDS-PAGE凝膠以備電泳。SDS-PAGE凝膠電泳分離制備的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，上樣量為20μg，同時使用預(yù)染蛋白Marker，依據(jù)分子量對所制備的蛋白進行鑒定。

1.2.4 Western blot鑒定目的蛋白免疫原性 Cav1.2鈣通道蛋白經(jīng)5.8%的SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，TBST洗膜后5%的BSA室溫封閉1 h，分別采用不同的抗Cav1.2抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL試劑曝光、顯影及定影，對膠片進行圖像采集。將膠片圖像輸入圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用CS analyzer 3.0軟件進行強度測定，結(jié)果以光密度值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同表面活性劑對Cav1.2鈣通道蛋白制備的影響

膜蛋白是通過疏水氨基酸殘基錨定在膜結(jié)構(gòu)中的，很難溶解在水性緩沖液中，因此，需要使用去污劑或表面活性劑以達到增溶的效果。用于增溶的去污劑有離子型和非離子型的，本研究選擇了兩種較為溫和的非離子型去污劑CHAPS和Triton X-100，嘗試制備心肌細胞膜Cav1.2鈣通道蛋白。心肌組織經(jīng)過勻漿離心后，上清再分別經(jīng)過2%CHAPS和1%TritonX-100的處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2%CHAPS處理的樣本，上清中可能含有較多的Cav1.2鈣通道蛋白，而1%Triton X-100處理過的上清并未分離得到Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 1)。因此，在制備心肌Cav1.2鈣通道蛋白時本研究選擇CHAPS作為增溶的去污劑。

Fig 1 Soluble effect of Cav1.2 protein treated by CHAPS and Triton X-100 detergent

進一步實驗使用了不同濃度的CHAPS觀察了Cav1.2鈣通道蛋白的增溶效果的不同。結(jié)果顯示(Fig 2)，不同濃度的CHAPS(2%、4%、6%)在鈣通道蛋白的增溶效果上并沒有明顯差別。同時，有研究表明高濃度的去污劑可能會對蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使蛋白質(zhì)失去天然的構(gòu)象。因此，后續(xù)研究采用了較低濃度的CHAPS(2%)制備心肌Cav1.2鈣通道蛋白。

Fig 2 Soluble effect of Cav1.2 protein treatedby different concentrations of CHAPS(2%，4%，6%)

2.2 WGA親和層析方法制備Cav1.2鈣通道蛋白 除了選擇合適的去垢劑，蛋白溶解液中的離子強度也是影響膜蛋白制備的重要因素。進一步實驗將用于溶解蛋白的Tris緩沖液中加入了氯化鉀(0.5 mol·L－1)，以促使細胞膜更好的溶解破裂。WGA是能夠特異結(jié)合Cav1.2鈣通道蛋白上糖蛋白的凝集素，經(jīng)氯化鉀處理后的蛋白溶解液，應(yīng)用WGA與蛋白溶解液孵育2 h后，經(jīng)5.8%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為220 ku處存在唯一蛋白條帶(Fig 3)。Cav1.2鈣通道蛋白分子質(zhì)量約220 ku，我們認(rèn)為本實驗采用WGA制備的蛋白為心肌Cav1.2鈣通道蛋白。2.3 Western blot鑒定Cav1.2鈣通道蛋白 根據(jù)上述實驗結(jié)果，為了更進一步鑒定所制備的蛋白為全長的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，本研究采用了Western blot的方法。使用兩種不同的心肌Cav1.2鈣通道蛋白的抗體對制備的蛋白進行鑒定，結(jié)果顯示應(yīng)用抗C末端(檢測1507-1733氨基酸片段)的抗體可檢測到心肌Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 4);應(yīng)用抗N末端(檢測1-46氨基酸片段)的抗體同樣也可檢測到心肌Cav1.2鈣通道蛋白(Fig 4)，此實驗結(jié)果表明，我們成功制備純化了全長心肌Cav1.2鈣通道蛋白，且此蛋白純度較高。

Fig 3 Cardiac Cav1.2 channel protein was separated by 5.8%SDS-PAGE gel

Fig 4 The Cav1.2 channel protein identified by Western blot

3 討論

心肌L型鈣通道(Cav1.2鈣通道)是心肌細胞興奮時外鈣內(nèi)流的主要途徑，研究表明［7－9］，心肌L型鈣通道與許多心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如心肌L型鈣通道與心律失常、心肌肥大、心力衰竭等有關(guān)。關(guān)于心肌L型鈣通道的研究非常廣泛，研究方法也很多，由于實驗?zāi)康牟煌?，采用的方法也不同。例如采用電生理的方法對心肌L型鈣通道的功能進行研究［10－11］，應(yīng)用共聚焦顯微鏡可測定單個心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度，Western blot的方法是檢測鈣通道蛋白比較常用的方法等。然而本研究采用親和層析的方法提取制備了純度較高的心肌全長Cav1.2鈣通道蛋白，為系統(tǒng)研究鈣通道奠定了堅實的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用是細胞生化反應(yīng)的重要組成部分，對調(diào)控細胞信號具有重要意義。目前，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的方法有很多，如酵母雙雜交、免疫共沉淀以及pull-down技術(shù)等。研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白質(zhì)可與心肌Cav1.2鈣通道結(jié)合，并且多采用制備不同標(biāo)簽的融合蛋白的方法來獲得Cav1.2鈣通道的不同片段，應(yīng)用Cav1.2鈣通道的不同片段進行進一步的蛋白與蛋白結(jié)合實驗的研究［6，12］。這種方法在研究全長Cav1.2鈣通道蛋白與其他蛋白結(jié)合實驗中存在缺點，由于Cav1.2鈣通道蛋白的分子質(zhì)量約為220 ku，而采用不同標(biāo)簽的融合蛋白制備方法很難獲得分子質(zhì)量很大的蛋白，因此，本研究探索制備了全長的Cav1.2鈣通道蛋白，為檢測某些蛋白與全長鈣通道蛋白結(jié)合研究提供了方便，也為應(yīng)用全長的Cav1.2鈣通道蛋白進行相關(guān)的實驗研究提供新的方法。

親和層析法制備全長的心肌Cav1.2鈣通道蛋白，是體外系統(tǒng)研究鈣通道蛋白的前提和基礎(chǔ)。研究表明［13－15］，很多細胞內(nèi)因子可與鈣通道直接結(jié)合，如鈣離子、鈣調(diào)蛋白以及鈣調(diào)蛋白抑素等，它們在鈣通道上的結(jié)合位點是目前研究的熱點，在某些疾病狀態(tài)下，這些細胞因子與鈣通道的結(jié)合可能會發(fā)生改變，通過制備全長鈣通道蛋白可為尋找這些細胞內(nèi)因子在鈣通道上的結(jié)合位點奠定基礎(chǔ)。因此，對鈣通道蛋白純化方法的研究不僅對鈣通道在蛋白水平的研究具有很大的促進作用，也為與鈣通道相關(guān)的心血管系統(tǒng)疾病的研究拓寬了思路。

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