芽胞桿菌T61的輻射抗性和伽瑪射線輻照后蛋白質(zhì)組的變化分析

宣慧娟 李 利 白明艷 孫云峰 萬 平 楊志偉

（首都師范大學生命科學學院 北京 100048）

生物體輻射抗性的機理一直是人們關注的熱點。耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今發(fā)現(xiàn)的具有極強輻射抗性的微生物之一，對其輻射抗性機制的研究也最為透徹[1-5]。迄今為止，大量研究主要集中在DNA修復能力方面[6-8]。近年來，Daly 等[9-10]認為抗氧化保護是輻射抗性的關鍵因素。這一假說提出電離輻射可以導致水光解，產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)會損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子。因此推測有機體抗氧化能力的高低決定了其輻射生存率。在耐輻射奇異球菌中，研究表明Mn復合物是ROS的有效清除劑，但不同生物體可能具有不同的輻射抗性機制[11]。

芽胞桿菌也存在輻射抗性現(xiàn)象。蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)的表面S-層蛋白可賦予細胞更強的輻射抗性[12]?？莶菅堪麠U菌(Bacillus subtilis)的非同源末端連接(NHEJ)參與了輻射后DNA的修復[13]。在巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)等其它芽胞桿菌中，電離輻射可以影響多個細胞代謝途徑，包括DNA重組、蛋白質(zhì)更新和脅迫響應機制等[14-18]。但目前對芽胞桿菌輻射抗性機理的研究還十分有限。

芽胞桿菌T61(Bacillus sp. T61)是從西藏土樣中分離得到的一株具有較強輻射抗性的菌株。本研究測定了該菌株對γ-射線的輻射抗性，并研究了γ-射線輻照后芽胞桿菌T61在蛋白質(zhì)組水平發(fā)生的變化，以期發(fā)現(xiàn)細菌輻射抗性的新機制，拓展對生物體輻射抗性的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和培養(yǎng)條件

本研究所用菌株為芽胞桿菌 T61，來自西藏岡巴拉山土樣，由本實驗室分離保存。對照菌株 D.radiodurans (CGMCC 1.633) 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，E. coli K12由中國農(nóng)業(yè)科學院張維研究員饋贈。芽胞桿菌T61和耐輻射奇異球菌用TGY培養(yǎng)基(0.5%胰蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖)30 ℃培養(yǎng)，E. coli K12用LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl) 37 ℃培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

B-PER 細菌總蛋白抽提試劑盒(Thermo scientific)；雙向電泳相關試劑(GE healthcare)；Ultrospec 3100 pro 紫外可見分光光度計(GE healthcare)；Ettan IPGphor 3 等電聚焦儀(GE healthcare)；垂直電泳儀(BIO-RAD)；ImageScanner III 掃描儀(GE healthcare)；4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer (ABI)；60Co γ-射線射源（北京大學化學與分子工程學院應用化學系鈷源室）。

1.3 芽胞桿菌T61的γ-射線輻射抗性的分析

將芽胞桿菌T61菌株接種于TGY培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)早期(A600=0.3-0.4)。離心收集菌體，用0.1 mol·L-1的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗一次，并重新懸浮于等體積的磷酸鉀緩沖液中。取1.5mL 菌液加到1.5mL EP 管中，室溫下(10- 20 ℃)進行60Co γ-射線輻照（劑量率 10 Gy·min-1)，輻射劑量分別為2、4、6、8和10 kGy。輻射后，分別用0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液適當稀釋，取稀釋液涂布于TGY平板，30 ℃培養(yǎng)。計算輻射存活率。以對數(shù)早期D. radioduran 和E. coli K12細胞為對照。

1.4 輻射處理和細胞可溶性蛋白的提取

將培養(yǎng)至對數(shù)早期(A600=0.3-0.4)的芽胞桿菌T61菌液分為兩部分，一部分進行10 kGy60Co γ-射線輻射，另一部分作為對照，同樣條件下放置，未經(jīng)輻射。輻射后離心收集菌體，-20 ℃儲存。

處理組（γ-射線輻射）和對照組（未輻射）菌體各3g，分別懸浮于適當體積的B-PER? Reagent(Pierce)中，補加 0.2 μmol·mL-1PMSF 和 200 μg·mL-1溶菌酶，輕微搖動 20 min。4 ℃ 15000g離心15 min，上清液轉移至新管，加入1.2倍體積的Tris飽和酚，冰上渦旋20 min。4 ℃ 20000g離心20 min，酚相（下相）轉移至新管，加入5倍體積0.1 mol·L-1乙酸銨（甲醇配制），混勻，-20 ℃靜置2 h。4 ℃ 20000g離心10 min，沉淀用無水乙醇和丙酮（含0.07% β-巰基乙醇）各洗一次，冷凍干燥，-20℃保存。

1.5 雙向電泳分離蛋白質(zhì)

將蛋白質(zhì)樣品溶于適量上樣緩沖液(8 mol·L-1Urea, 2% CHAPS, 50 mmol·L-1DTT 和 0.5% IPG buffer pH=4-7)中，采用 Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。按照生產(chǎn)廠商(GE Healthcare)的使用說明進行雙向電泳分析。首先取340 μL樣品（含800 μg蛋白）加入水化盤中，放入18 cm的膠條 (18 cm, pH 4-7)，水化18 h。水化結束后，采用Ettan IPGphor III進行等電聚焦，聚焦程序為250 V，3 h；500 V，2 h；1000 V，1 h；10000 V，3 h；10000 V，100000 Vh；500 V，20 h。聚焦完畢，平衡后進行第二向SDS-PAGE，分離膠濃度為 12.5%。用考馬斯亮藍G-250染液染色過夜，次日進行脫色。將脫色后的凝膠用ddH2O清洗，采用ImageScanner III 掃描儀進行圖像采集，用BIO-RAD PDQuestTM2-D Analysis Software 8.0.1對圖像進行分析。

處理組和對照組分別提取了3次蛋白質(zhì)樣品，每個樣品至少進行2次雙向電泳分離。從凝膠上切取表達量發(fā)生2倍以上變化的蛋白質(zhì)樣點進行質(zhì)譜分析。

1.6 質(zhì)譜分析和差異蛋白的數(shù)據(jù)庫查詢

差異蛋白送交上海中科新生命生物科技有限公司進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析。采用MASCOT搜索軟件在NCBI非冗余庫 (NCBInr) 中進行肽譜比對，根據(jù)蛋白質(zhì)得分(C. I. % >95%)、肽段的匹配數(shù)目(≥5)和序列覆蓋度(>15%)等評價蛋白質(zhì)鑒定的可靠性。

2 結果與討論

2.1 芽胞桿菌T61的γ-射線輻射抗性分析

芽胞桿菌T61對γ-射線的輻射抗性遠高于對照菌株大腸桿菌K12。在本實驗條件下，當輻射劑量為 1 kGy時，大腸桿菌 K12的生存率接近于0.0001%，而T61的生存率約為40%。隨著輻射劑量的增加，T61存活率下降，D10為4 kGy。當輻射劑量為10 kGy時，存活率為0.002%，比耐輻射奇異球菌低100倍（見圖1）。

圖1 芽胞桿菌T61 γ-射線輻照后的存活曲線Fig.1 Survival curves of strain Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

2.2 γ-射線輻射后芽胞桿菌T61蛋白組的變化

對處理組（γ-射線輻射）和對照組（未輻射）可溶性蛋白進行雙向電泳分析，代表性電泳圖譜如圖2所示。在每塊膠上可分離得到900多個蛋白點，這些蛋白點主要集中在分子量20-100 kDa，pH4-7的范圍內(nèi)。與未經(jīng)輻射的蛋白質(zhì)樣品相比，10kGy60Co γ-射線輻射后至少有 30個蛋白質(zhì)點出現(xiàn)顯著變化。其中22個蛋白點上調(diào)為輻射前的兩倍以上，8個蛋白點下調(diào)為輻射前的二分之一以下。

圖2 輻照前(a)后(b)芽胞桿菌T61的蛋白質(zhì)組圖譜Fig.2 Protein profile of Bacillus sp. T61 cells before (a) and after (b) irradiation

根據(jù)雙向電泳的分析結果，對輻射后發(fā)生顯著變化的 30個蛋白點進行 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，鑒定結果如表1所示。其中有4個蛋白點(2203,3202, 4601, 6101)含有兩種蛋白，因此30個蛋白點包括34種蛋白質(zhì)，其中25個蛋白質(zhì)上調(diào)，9個蛋白質(zhì)下調(diào)。進一步根據(jù)NCBI 蛋白相鄰類的聚簇分析(Cluster of orthologous groups of proteins, COGs)對這些差異蛋白質(zhì)進行了分類，它們分屬信息貯存和加工、細胞過程和信號、代謝和未鑒定蛋白四大類，主要涉及細胞的抗氧化防御、核苷酸代謝、能量代謝、轉錄以及蛋白質(zhì)的翻譯和更新等過程。

在這些差異表達的蛋白質(zhì)中，引人注目的是，一大組抗氧化酶類在輻射后上調(diào)表達，包括醛-酮還原酶（蛋白點2308和5406)、巰基過氧化物酶（蛋白點2105)、烷基過氧化氫還原酶（蛋白點1201）、Mn-超氧化物歧化酶（蛋白點3202）和硝基還原酶家族蛋白（蛋白點3202）等（圖3）。在耐輻射奇異球菌中也觀察到超氧化物歧化酶(SOD)等在輻射后表達量增加[19]。本研究首次發(fā)現(xiàn)醛-酮還原酶(AKR)在輻射后顯著上調(diào)表達。由于醛-酮還原酶是一種NAD(P)H依賴型的氧化還原酶類，可以催化多種脂肪族和芳香族醛、酮類物質(zhì)的還原[20]，我們推測醛-酮還原酶可能參與了輻射后脂類過氧化物的解毒過程，但具體機制有待進一步研究。

在對抗輻射導致的氧化脅迫方面，除抗氧化酶類上調(diào)之外，一些可以減少活性氧自由基生成的酶類也發(fā)生了變化。琥珀酸脫氫酶（蛋白點8802）在輻射后上調(diào)5.2倍， 該酶氧化還原中心的有效排列可以使電子快速轉移給泛醌，從而減少了電子傳遞過程中自由基的產(chǎn)生[21]。亞硫酸還原酶β-亞基（蛋白點 8806）和 4-羥基-3-甲丁基-2-烯-1-基-二磷酸合成酶(GcpE，蛋白點 8504）分別具有一個[4Fe-4S]簇，該鐵硫簇容易受到O2·-和 H2O2的攻擊，繼而產(chǎn)生羥基自由基(·OH)[22-23]。輻射后亞硫酸還原酶β-亞基和GcpE下調(diào)，從而可以進一步減少輻射后自由基的生成。

輻射后芽胞桿菌T61下調(diào)有氧氧化途徑，而以酵解為獲得能量的主要方式，這一點與耐輻射奇異球菌十分相似[3]。輻照后，可以觀察到參與酵解途徑的一些酶類，例如磷酸丙糖異構酶（蛋白點1308）和果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（蛋白點3301）和乳酸脫氫酶（蛋白點7401）上調(diào)表達，而三羧酸循環(huán)(TCA)酶類，例如丙酮酸脫氫酶復合體E3（蛋白點4805）和丙酮酸脫氫酶E1α亞基（蛋白點8503）下調(diào)表達。此外，芽胞桿菌還可能利用細胞內(nèi)其它代謝物獲得能量，例如丁醇脫氫酶（蛋白點3503）和聚羥基烷酸合酶（蛋白點2203）在輻射后上調(diào)，二者分別參與丁醇[24]和聚羥基烷酸(PHAs)[25]的代謝。

表1 γ-射線輻射后芽胞桿菌T61差異蛋白質(zhì)的功能注釋Table 1 Functional annotation of the cellular proteins changed in Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

續(xù)表

圖3 γ-射線輻照后表達量增加的抗氧化酶類（局部放大圖）未輻照(a)；輻照后(b)；從左至右：蛋白點1201, 2105, 2308, 3202, 5406Fig.3 Zoomed view of antioxidation enzymes enhanced by γ-ray irradiation

輻射后細胞除抵抗氧化脅迫外，還需要修復DNA損傷。本研究發(fā)現(xiàn)5種參與核苷酸代謝的酶類在輻照后上調(diào)，包括磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶（蛋白點2302）、絲氨酸羥甲基轉移酶（蛋白點7607和8601）、前咕啉-8X甲基變位酶（蛋白點8203）、腺苷酸激酶（蛋白點5203）和鳥苷酸激酶（蛋白點2203和 4201）。其中絲氨酸羥甲基轉移酶和鳥苷酸激酶分別具有兩種亞型，其分子量相同，但等電點發(fā)生變化，暗示出輻射過程中可能發(fā)生了蛋白質(zhì)修飾。

輻射后轉錄和翻譯系統(tǒng)也發(fā)生了一些變化。轉錄延伸因子GreA（蛋白點1103）、核糖體再循環(huán)因子（蛋白點 8101）和多肽脯氨酰順反異構酶(PPI)親環(huán)蛋白型（蛋白點 6101）在輻射后上調(diào)。在D.radiodurans也觀察到轉錄延伸因子和PPI在輻射后表達量增加[19,26-27]。觸發(fā)因子（蛋白點 1802）是PPI家族的成員[28]，在輻射后下調(diào)。翻譯延伸因子EFTu（蛋白點2603）也出現(xiàn)下調(diào)。但在D.radiodurans和其它Bacillus的輻射后恢復生長中，EFTu是上調(diào)表達的[29-30]，推測EFTu 在輻射過程中被降解，但可能在細胞恢復生長中被重新合成。

在蛋白質(zhì)的降解方面，研究表明 Clp 蛋白酶（蛋白點8903）下調(diào)，而肽酶T（蛋白點2501）上調(diào)，推測不同類型的蛋白酶可能參與了輻射后受損蛋白質(zhì)的降解。

無機離子和有機小分子在輻射抗性中的作用日益受到重視。在D.radiodurans中，Mn(II)-復合物可以清除輻射產(chǎn)生的自由基[11]。在 Halobacterium NRC-1中，高濃度的Br-可以增強細胞輻射抗性[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，一種功能未知的蛋白，YrhD-類似蛋白（蛋白點6101）在輻射后顯著上調(diào)表達。在巨大芽胞桿菌中，這一基因兩側是 modA (編碼鉬 ABC轉運蛋白)和yrhE（編碼鉬氧化還原酶家族蛋白）[32]，暗示出 YrhD-類似蛋白可能參與鉬代謝，其與輻射抗性的關系尚需進一步研究。

3 結論

芽胞桿菌 T61是一種具有較強輻射抗性的菌株，在10 kGy γ-射線輻射后，芽胞桿菌T61蛋白質(zhì)組發(fā)生了以下變化：(1)多種類型抗氧化酶在輻射后上調(diào)，推測抗氧化保護在T61輻射抗性中發(fā)揮關鍵作用；(2)輻射過程中，細胞主要通過酵解或利用其它代謝物獲得能量；(3)核苷酸從頭合成途徑的上調(diào)有利于促進DNA的修復；(4)轉錄和翻譯系統(tǒng)的啟動以保證受損蛋白質(zhì)的修復和新蛋白質(zhì)的再合成。圖4概括了芽胞桿菌T61細胞蛋白質(zhì)組在60Co γ-輻射過程中所發(fā)生的主要變化。

本研究首次發(fā)現(xiàn)醛-酮還原酶在輻射后顯著上調(diào)。由于醛-酮還原酶超家族可以催化脂類物質(zhì)過氧化形成的醛類物質(zhì)的還原，因而在輻射后的抗氧化保護中發(fā)揮重要作用。我們目前正在進行醛-酮還原酶基因缺失突變體的構建和功能分析，初步研究結果表明醛-酮還原酶基因的缺失可使菌株的輻射抗性降低，相關生物學功能的分析正在進行中。

圖4 γ-射線輻照后芽胞桿菌T61細胞蛋白質(zhì)組變化圖解Fig.4 Main change scheme of cellular proteins in Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

致謝感謝崔素霞教授在蛋白質(zhì)組學分析方面給予的建議和指導。感謝北京大學化學與分子工程學院應用化學系鈷源室為60Co γ-射線輻照處理提供的幫助。

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