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    H1299旁效應(yīng)細(xì)胞對(duì)X-射線輻射的適應(yīng)性與 TGF-β1通路相關(guān)

    2014-09-28 01:51:58蔣友芹田文倩尹曉明王敬東楊紅英
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液適應(yīng)性存活率

    蔣友芹 田文倩 尹曉明 王敬東 楊紅英

    (蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院/放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123)

    傳統(tǒng)放射生物學(xué)中的標(biāo)靶理論認(rèn)為細(xì)胞只有受到直接電離輻射,才會(huì)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。然而,近幾十年來(lái)關(guān)于電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)和適應(yīng)性等現(xiàn)象的研究結(jié)果嚴(yán)重質(zhì)疑了該理論的準(zhǔn)確性。旁效應(yīng)是指受照射細(xì)胞傳遞信號(hào)給未受照射細(xì)胞,從而使未受照射細(xì)胞發(fā)生一系列諸如基因表達(dá)改變[1-2]、基因突變[3-4]、DNA損傷[5-6]、細(xì)胞死亡[1,7]及惡性轉(zhuǎn)化[8]等的生物學(xué)改變。目前為止,大量體外[1,8]、體內(nèi)[9]證據(jù)證實(shí)了輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的存在。傳統(tǒng)的適應(yīng)性描述的是當(dāng)細(xì)胞先用一個(gè)小劑量照射后,再接受大劑量照射時(shí)變得具有抗性的現(xiàn)象,這個(gè)現(xiàn)象在體內(nèi)外均曾被觀察到[10-11]。

    近年來(lái)有證據(jù)顯示電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間可能存在關(guān)聯(lián)[12]。輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)細(xì)胞在受到大劑量照射時(shí)與適應(yīng)性現(xiàn)象中的細(xì)胞預(yù)先受過(guò)小劑量照射一樣變得具有抗性[13]。相反地,預(yù)先給予旁效應(yīng)細(xì)胞一個(gè)低劑量照射可使旁效應(yīng)不再出現(xiàn)[14]。然而這樣的關(guān)聯(lián)并非具有普適性。例如,研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)的H460和A549旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性反而增加了[15]。這些看似矛盾的結(jié)果表明深入研究旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間的關(guān)系將有助于對(duì)這些現(xiàn)象分子機(jī)制的理解。

    研究顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)可能在輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[16-17]。加入TGF-β1抑制劑之后,T98G細(xì)胞輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)現(xiàn)象(微核形成和細(xì)胞存活能力)消失了[16-17],提示受照射細(xì)胞釋放出的 TGF-β1信號(hào)因子可能作用于旁效應(yīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生自由基,從而導(dǎo)致 DNA損傷[16]。但是 TGF-β1是否也在適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用卻鮮有報(bào)道。另外,錳超氧化物歧化酶(SOD2)被發(fā)現(xiàn)參與了傳統(tǒng)適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生[18]。因此本研究以H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,研究輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)細(xì)胞是否存在適應(yīng)性的現(xiàn)象,并探討TGF-β1信號(hào)通路和SOD2在此過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑

    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;RPMI1640培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)和TGF-βR1抑制劑(SB431542)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;HEPES緩沖液購(gòu)自中國(guó)南京旋光科技有限公司;青霉素-鏈霉素、胰酶消化液和抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所;抗SOD2小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司;化學(xué)發(fā)光劑(ECL)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和輻照

    H1299細(xì)胞以適當(dāng)比例接種于含有10%胎牛血清、2.5g·L–1葡萄糖、1 mmol·L–1丙酮酸鈉、100 U·mL–1青霉素、100 μg·mL–1鏈霉素及 1 mmol·L–1HEPES (pH 7.2)的 RPMI1640培養(yǎng)液中,放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液。

    細(xì)胞在 20℃下采用美國(guó) RAD SOURCE RS2000 X-射線機(jī)進(jìn)行照射,能量為160 kVp,距離為40 cm,劑量率為1.16 Gy·min–1。用來(lái)提取照射條件培養(yǎng)液的細(xì)胞吸收劑量為5 Gy,用來(lái)研究輻射適應(yīng)性的吸收劑量為2 Gy。

    1.2.2 條件培養(yǎng)液的提取

    本文采用培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法獲得經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞。取100–120萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于100mm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后,更換新鮮的培養(yǎng)液并用X-射線照射,劑量為5 Gy。繼續(xù)培養(yǎng)1 h或18 h后,收集培養(yǎng)液并用無(wú)菌過(guò)濾器(Ф 0.22 μm)過(guò)濾以去除細(xì)胞碎片。為方便起見(jiàn),在本文中提供旁效應(yīng)信號(hào)的照射細(xì)胞被稱為信號(hào)細(xì)胞,接收條件培養(yǎng)液處理的未照射細(xì)胞被稱為旁效應(yīng)細(xì)胞。照射后1 h和18 h收集的條件培養(yǎng)液分別被稱為1 h照射條件培養(yǎng)液(1 h RCM)和 18 h照射條件培養(yǎng)液(18h RCM)。相對(duì)應(yīng)的未照射組被稱為未照射條件培養(yǎng)液(1 h SCM和18 h SCM)。另外,采用新鮮培養(yǎng)液作為空白對(duì)照(Control)。

    1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于60mm的培養(yǎng)皿中,每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞,每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行樣。24 h后,去除原培養(yǎng)液,分別更換為新鮮培養(yǎng)液、1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM,繼續(xù)培養(yǎng)13 d之后,棄培養(yǎng)液,用PBS快速洗3遍,甲醇固定15 min、亞甲基藍(lán)染色30 min,用清水將培養(yǎng)皿洗凈晾干。于顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落??寺⌒纬陕屎图?xì)胞克隆存活率按如下公式計(jì)算:克隆形成率(%) =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%;細(xì)胞克隆存活率 =處理組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率。

    1.2.4 Western Blotting檢測(cè)旁效應(yīng)細(xì)胞的SOD2表達(dá)水平

    旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM培養(yǎng)3 h或5 h后,用預(yù)冷的PBS溶液沖洗 3遍,加入適量細(xì)胞裂解液(0.1%曲拉通X-100、10 mmol·L–1Tris (pH 7.4)、10%甘油、150 mmol·L–1氯化鈉、5 mmol·L–1EDTA、1 mmol·L–1原釩酸鈉、1 mmol·L–1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 0.1%蛋白酶抑制劑),在4 ℃裂解30 min后,13000×g 4 ℃離心10 min,取上清,并用Bradford蛋白定量方法測(cè)定蛋白濃度。取適量樣品并加入 1/4體積的5×SDS-PAGE上樣緩沖液,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。然后用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(200 V, 30-60 min)。等到蛋白分離完成后,將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜(100 mA, 2 h)。膜用含5%脫脂奶粉的 TBST(100 mmol·L–1Tris-HCl/pH7.5, 0.9% NaCl,0.1% Tween-20)進(jìn)行非特異性封閉。加入抗 SOD2小鼠單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜,膜用TBST溶液清洗3遍,加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)室溫孵育45 min。膜用TBST清洗3遍,加入化學(xué)發(fā)光劑(ECL),用多功能激光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)Amersham公司Typhoon 9410)進(jìn)行曝光成像。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)都是至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均,并用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(±s)。采用Origin 8.0軟件的 Student’s T檢驗(yàn)進(jìn)行組與組間的比較分析,p<0.05被認(rèn)為兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各條件培養(yǎng)液對(duì)旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率無(wú)影響

    本研究采用培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移的方法,檢測(cè)了X-射線誘導(dǎo) H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆形成能力的改變情況。如圖1所示,與正常對(duì)照組相比,1 h 和18 h收集的未照射條件培養(yǎng)液并未改變旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆形成能力,且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的照射條件培養(yǎng)液也未改變旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率,提示X-射線不能誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞克隆能力的改變。

    2.2 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞對(duì)X-射線照射出現(xiàn)適應(yīng)性

    本研究探討了用照射和未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞,經(jīng)2 Gy的X-射線照射后,其細(xì)胞克隆存活率的改變情況。如圖2a所示,與未受照射細(xì)胞相比,H1299細(xì)胞直接接受2 Gy照射后其克隆存活率降低了14% (p<0.01);但如果細(xì)胞先在培養(yǎng)過(guò)未受照射 H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(1 h SCM)中培養(yǎng)24 h后再接受照射,其克隆存活率與未受照細(xì)胞相比只降低了4% (p=0.085),與直接照射細(xì)胞相比卻增加了12% (p<0.01);而細(xì)胞如果先在培養(yǎng)過(guò)受照 H1299細(xì)胞的照射條件培養(yǎng)液(1 h RCM)中培養(yǎng)24 h后再接受照射,其克隆存活率竟超過(guò)了未受照射細(xì)胞,增加了約5% (p=0.068),與直接照射細(xì)胞相比增加了22% (p=0.012)。并且,用長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)未受照和受照H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(18 h SCM和18 h RCM)培養(yǎng)后再接受照射,細(xì)胞的克隆存活率進(jìn)一步增加,與未受照細(xì)胞相比,分別增加了20%和31%,比直接照射細(xì)胞分別增加了38%和 52%(圖 2b)。有意思的是,無(wú)論照后 1 h還是18 h收集的條件培養(yǎng)液,RCM培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞與 SCM 培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞相比,其受照后克隆存活率都約高10%。這些結(jié)果提示H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后出現(xiàn)了對(duì)輻射的適應(yīng)性,而照射條件培養(yǎng)液進(jìn)一步增加了這種適應(yīng)性,并且該適應(yīng)性的大小與收集條件培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)。

    圖1 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)液(1 h SCM、1 h RCM、18 h SCM或18 h RCM)培養(yǎng)后的克隆存活率Fig.1 The clonogenic cell survival of H1299 unirradiated bystander cells cultured in SCM or RCM harvested at 1 h or 18h post-irradiation

    圖2 接受不同處理的H1299細(xì)胞受照后的克隆存活能力:(a) 1 h 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加照2 Gy;(b) 18 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加照2 Gy(*代表兩組相比,p<0.05)Fig.2 The survival fraction of H1299 bystander cells irradiated with 2 Gy X-rays after cultured in 1 h conditioned medium (a)or 18 h conditioned medium (b) for 24 h (*p<0.05 vs. relative controls)

    2.3 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性與 TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)

    為了探討 TGF-β1信號(hào)通路是否參與了輻射誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性,我們?cè)谡丈淝坝?10 μmol·L–1TGF-βR1 抑制劑(SB431542)預(yù)處理信號(hào)細(xì)胞1 h或收集條件培養(yǎng)液后直接將SB431542加入到條件培養(yǎng)液中,然后用與上述相同的方法培養(yǎng)旁效應(yīng)細(xì)胞,觀察SB431542對(duì)輻射誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞輻射適應(yīng)性的影響。10 μmol·L–1的SB431542對(duì)H1299細(xì)胞的短期增殖和長(zhǎng)期克隆形成均無(wú)顯著影響,SB431542聯(lián)合2 Gy照射與單獨(dú)照射相比,也未造成克隆形成率的顯著降低(未發(fā)表數(shù)據(jù))。圖3顯示,當(dāng)信號(hào)細(xì)胞在照前用SB431542預(yù)處理1 h后,1 h SCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射,其克隆存活率比直接照射組低7% (p=0.34),比未加SB431542組降低了20% (p =0.02);1 h RCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射,其克隆存活率比直接照射組低11% (p=0.03),比未加SB431542組降低了32% (p<0.01)。SCM組與RCM組間無(wú)顯著性差異;而用18 h SCM和18 h RCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射,其克隆率與直接照射組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,卻比未加 SB431542組分別降低了 19%和30%,并且SCM組和RCM組間也沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果顯示當(dāng)用SB431542抑制了信號(hào)細(xì)胞中的TGF-β1通路后,條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性消失了。另一方面,當(dāng) SB431542直接加到條件培養(yǎng)液中后,1 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后,其克隆率仍較直接照射組高,與未加SB431542組無(wú)顯著差異,并且 SCM 和 RCM 組間仍有 13%的差異,顯示用SB431542抑制旁效應(yīng)細(xì)胞自身的TGF-β1通路并不影響1 h條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性;然而,用含有SB431542的18 h SCM和18 h RCM培養(yǎng)過(guò)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后,其克隆存活率較未加 SB431542組分別降低了 28%和18%,18 h SCM組甚至降至直接照射組水平,但是18 h SCM組和18 h RCM組間差異增大至24%,提示用SB431542抑制旁效應(yīng)細(xì)胞自身的TGF-β1通路消除了未照射條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性,但卻增加了照射條件培養(yǎng)液和未照射條件培養(yǎng)液之間的差異。所有這些結(jié)果表明信號(hào)細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞中的TGF-β1信號(hào)通路對(duì)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性有著重要的調(diào)控作用。

    圖3 TGF-βR1抑制劑(SB431542)對(duì)X-射線誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞輻射適應(yīng)性的影響(*代表兩組相比,p<0.05)Fig.3 The effects of SB431542 on the radiation adaptive response in bystander cells after cultured in conditioned medium harvested at 1 h and 18 h post-irradiation

    2.4 照射條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平下降

    我們通過(guò)western blotting檢測(cè)了各條件培養(yǎng)液培養(yǎng)旁效應(yīng)細(xì)胞3 h和5 h后細(xì)胞中SOD2的表達(dá)情況。如圖4所示,1 h RCM培養(yǎng)3 h和5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2的表達(dá)水平均降低了;18 h RCM培養(yǎng)3 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變,但是培養(yǎng)5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平發(fā)生了明顯的下降。

    圖4 采用Western Blotting 檢測(cè)各條件培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h和5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平改變情況Fig.4 The alterations of SOD2 expression in bystander cells cultured in conditioned medium harvested at different times post-irradiation for 3 h and 5 h, respectively, which was determined by Western Blotting

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    本研究證實(shí)雖然 X-射線不能影響 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活能力,卻可以降低旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性,即旁效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)了輻射適應(yīng)性。具體表現(xiàn)為與未照射培養(yǎng)液和未處理細(xì)胞相比,在照后1 h或18 h 收集的照射條件培養(yǎng)液均不能改變H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率(圖1)。然而有趣的是,旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后加照2 Gy,其克隆存活率竟比單獨(dú)照射組的高(圖2),提示未照射條件培養(yǎng)液可在H1299細(xì)胞中誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng),換句話說(shuō),H1299細(xì)胞自身就可釋放某種信號(hào)因子給接收細(xì)胞使其產(chǎn)生輻射抗性;旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后加照2 Gy,其克隆存活率不僅較單獨(dú)照射組高,并且顯著高于未照射條件培養(yǎng)液組(圖2),表明X-射線誘導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)了適應(yīng)性反應(yīng),也即是X-射線誘導(dǎo)受照細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)因子,從而使旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性降低。這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的結(jié)果不一致,該研究顯示與接受未照射培養(yǎng)液處理后加照2 Gy的細(xì)胞相比,H460和A549細(xì)胞在接受其照射條件培養(yǎng)液處理后加照2 Gy,其克隆存活率顯著降低,即旁效應(yīng)細(xì)胞未發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)。巧合的是H460細(xì)胞和A549細(xì)胞剛好都具有野生型的tp53,而H1299細(xì)胞的tp53是突變型的。tp53是否在輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性中發(fā)揮某種作用需要進(jìn)一步研究。這些結(jié)果與傳統(tǒng)的適應(yīng)性反應(yīng)不相同,有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的適應(yīng)性反應(yīng)發(fā)生在野生型tp53的細(xì)胞中,而不發(fā)生在突變型tp53的細(xì)胞中[20]。這些提示旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性與傳統(tǒng)的輻射適應(yīng)性可能不同。另外令人驚訝的是,旁效應(yīng)細(xì)胞接受2 Gy的X-射線照射后,其克隆形成率居然大于未處理細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),H1299細(xì)胞含有81.3%的CD44陽(yáng)性細(xì)胞,而這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多能性和間質(zhì)轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物,具有干細(xì)胞的自我更新和分化潛能的特點(diǎn),成瘤效率較CD44陰性細(xì)胞高,對(duì)順鉑具有抗性,并且長(zhǎng)期的順鉑處理將導(dǎo)致 CD44+細(xì)胞的比例增加到96.2%[21];另一方面,2 Gy的γ-射線照射可以促進(jìn)異質(zhì)非干細(xì)胞腫瘤細(xì)胞群中腫瘤干細(xì)胞的形成[22]。因此我們推測(cè)所觀察到的克隆形成率增加的原因可能是在此條件下,2 Gy的X-射線照射增加了旁效應(yīng)H1299細(xì)胞中CD44陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。該推測(cè)需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    我們已有的數(shù)據(jù)證實(shí) X-射線在 H1299細(xì)胞中誘導(dǎo)的旁效應(yīng)產(chǎn)生過(guò)程中,受照信號(hào)細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1信號(hào)通路都被激活,并且對(duì)旁效應(yīng)的各個(gè)終點(diǎn)(DNA損傷、ROS水平及細(xì)胞增殖等)的產(chǎn)生發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究顯示 TGF-β1信號(hào)通路對(duì)輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)起著復(fù)雜的作用。當(dāng)信號(hào)細(xì)胞的TGF-β1信號(hào)通路被抑制后,條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性不再產(chǎn)生,輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性也消失了。這些結(jié)果表明信號(hào)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路對(duì)旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生起著非常關(guān)鍵的作用。這些結(jié)果提示所觀察到的適應(yīng)性反應(yīng)的確是由旁效應(yīng)介導(dǎo)的,所以一旦通過(guò)抑制信號(hào)細(xì)胞的 TGF-β1通路來(lái)抑制旁效應(yīng)后,旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性就不再發(fā)生了。另一方面,當(dāng)旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1通路被抑制后,1 h收集的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性仍然存在,而18 h收集的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性都降低了,但照射條件培養(yǎng)液與未照射條件培養(yǎng)液之間的差異卻增大了,提示旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1通路在不同時(shí)間點(diǎn)提取的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮的作用不相同,并且可能還有別的關(guān)鍵通路參與了旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)這一過(guò)程。這些結(jié)果提示旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性與傳統(tǒng)適應(yīng)性可能源于不同的機(jī)制,因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)適應(yīng)性的發(fā)生與TGF-β無(wú)關(guān)[23]。

    表明輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性與傳統(tǒng)的適應(yīng)性不同的另一個(gè)證據(jù)是旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2的表達(dá)。在傳統(tǒng)適應(yīng)性反應(yīng)中,低劑量電離輻射預(yù)處理細(xì)胞后導(dǎo)致SOD2表達(dá)上升[18],從而介導(dǎo)了適應(yīng)性的發(fā)生;但本研究發(fā)現(xiàn)旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h 或5 h后,其胞內(nèi)SOD2表達(dá)水平卻下降了。我們已有的數(shù)據(jù)顯示 1 h RCM 可以引起H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的miR-21表達(dá)增加,18 h RCM卻導(dǎo)致H1299旁效應(yīng)細(xì)胞miR-21表達(dá)下降(未發(fā)表數(shù)據(jù))。而 miR-21可以通過(guò) TNF-α間接調(diào)控SOD2[19]。因此miR-21表達(dá)的變化可能是本研究觀察到的 SOD2表達(dá)下降的一個(gè)主要原因。但 1 h RCM和18 h RCM引起H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中miR-21不同的改變,卻都引起了SOD2表達(dá)的降低,其中一個(gè)可能的解釋是因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同導(dǎo)致的,另一個(gè)可能的解釋是SOD2還有別的調(diào)控機(jī)制。這些結(jié)果提示,SOD2可能未參與輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生,但這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的直接證據(jù)。

    總之,本研究證實(shí)了電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間存在關(guān)聯(lián)。伴隨著H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平的下降,X-射線誘導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞受照后發(fā)生了適應(yīng)性反應(yīng);并且該適應(yīng)性的發(fā)生依賴于信號(hào)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路,而旁效應(yīng)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路發(fā)揮的作用比較復(fù)雜,與照后收集條件培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)。研究結(jié)果還顯示電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)信號(hào)可作為一個(gè)類似小劑量照射的傳統(tǒng)適應(yīng)性中的誘導(dǎo)劑,但輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性卻不同于傳統(tǒng)適應(yīng)性,表現(xiàn)為SOD2和 TGF-β1信號(hào)通路在兩種現(xiàn)象中的調(diào)控作用不同。

    1 Yang H, Asaad N, Held K D. Medium-mediated intercellular communication is involved in bystander responses of X-ray irradiated normal human fibroblasts[J]. Oncogene, 2005, 24(12): 2096-2103.

    2 Azzam E I, De Toledo S M, Spitz D R, et al. Oxidative metabolism modulates signal transduction and micronucleus formation in bystander cells from alpha-particle-irradiated normal human fibroblast cultures[J]. Cancer Research, 2002, 62(19): 5436-5442.

    3 Nagasawa H, Huo L, Little J B. Increased bystander mutagenic effect in DNA double-strand break repair-deficient mammalian cells [J]. International Journal of Radiation Biology, 2003, 79(1): 35-41.

    4 Zhou H, Randers-Pehrsong, Waldren C A, et al.Induction of a bystander mutagenic effect of alpha particles in mammalian cells [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(5): 2099-2104.

    5 Azzam E l, De Toledo S M, Little J B. Direct evidence for the participation of gap junction-mediated intercellular communication in the transmission of damage signals from alpha-particle irradiated to nonirradiated cells [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(2): 473-478.

    6 Little J B. Genomic instability and bystander effects: a historical perspective [J]. Oncogene, 2003, 22(45):6978-6987.

    7 Lyng F M, Seymour C B, Mothersill C E. Initiation of apoptosis in cells exposed to medium from the progeny of irradiated cells: a possible mechanism for bystander induced genomic instability [J]. Radiation Research, 2002,157(4): 365-370.

    8 Sawant Sg, Randers-Pehrsong, Geard C R, et al. The bystander effect in radiation oncogenesis: I.transformation in C3H l0T cells in vitro can be initiated in the unirradiated neighbors of irradiated cells [J].Radiation Research, 2001, 155(3): 397-401.

    9 Jain M R, Li M, Chen W, et al. In vivo space radiation-induced non-targeted responses: late effects on molecular signaling in mitochondria [J]. Current Molecular Pharmacology, 2011, 4(2): 106-114.

    10 Olivierig, Bodycote J, Wolff S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. Science, 1984, 223(4636): 594-597.

    11 Wolff S. Is radiation all bad? The search for adaptation [J].Radiation Research, 1992, 131(2): 117-123.

    12 Zhou H, Randers-Pehrsong, Waldren C A, et al.Radiation-induced bystander effect and adaptive response in mammalian cells [J]. Advances in Space Research,2004, 34(6): 1368-1372.

    13 Maguire P, Mothersill C, McClean B, et al. Modulation of radiation responses by pre-exposure to irradiated cell conditioned medium [J]. Radiation Research, 2007,167(4): 485-492.

    14 Zhou H, Randers-Pehrsong, Geard C R, et al. Interaction between radiation-induced adaptive response and bystander mutagenesis in mammalian cells [J]. Radiation Research, 2003, 160(5): 512-516.

    15 Shareef M M, Cui N, Burikhanov R, et al. Role of tumor necrosis factor-A and TRAIL in high-dose radiationinduced bystander signaling in lung adenocarcinoma [J].Cancer Research, 2007, 67(24): 11811-11820.

    16 Shao C, Folkard M, Prise K M. Role of TGF-beta1 and nitric oxide in the bystander response of irradiated glioma cells [J]. Oncogene, 2008, 27(4): 434-440.

    17 Gow M D, Seymour C B, Ryan L A, et al. Induction of bystander response in human glioma cells using high-energy electrons: a role for TGF-beta1 [J]. Radiation Research, 2010, 173(6): 769-778.

    18 Guog, Yan-Sanders Y, Lyn-Cook B D, et al. Manganese superoxide dismutase- mediated gene expression in radiation-induced adaptive responses [J]. Molecular and Cellular Biology, 2003, 23(7): 2362-2378.

    19 Zhang X, Ng W L, Wang P, et al. MicroRNA-21 Modulates the Levels of Reactive Oxygen Species by Targeting SOD3 and TNFα [J]. Cancer Research, 2012,72(18): 4707-4713.

    20 Takahashi A, Su X, Suzuki H, et al. p53-dependent adaptive responses in human cells exposed to space radiations [J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 2010, 78(4): 1171-1176.

    21 Leung E L, Fiscus R R, Tung J W, et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties [J]. PLoS One, 2010, 5(11): e14062.

    22 Ghisolfi L, Keates A C, Hu X, et al. Ionizing Radiation Induces Stemness in Cancer Cells [J]. PLoS ONE, 2012,7(8): e43628.

    23 Dieriks B, De Vos W, Baatout S, et al. Repeated exposure of human fibroblasts to ionizing radiation reveals an adaptive response that is not mediated by interleukin-6 or TGF-β [J]. Mutation Research, 2011, 715(1-2): 19-24.

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