• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    H1299旁效應(yīng)細(xì)胞對(duì)X-射線輻射的適應(yīng)性與 TGF-β1通路相關(guān)

    2014-09-28 01:51:58蔣友芹田文倩尹曉明王敬東楊紅英
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液適應(yīng)性存活率

    蔣友芹 田文倩 尹曉明 王敬東 楊紅英

    (蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院/放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123)

    傳統(tǒng)放射生物學(xué)中的標(biāo)靶理論認(rèn)為細(xì)胞只有受到直接電離輻射,才會(huì)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。然而,近幾十年來(lái)關(guān)于電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)和適應(yīng)性等現(xiàn)象的研究結(jié)果嚴(yán)重質(zhì)疑了該理論的準(zhǔn)確性。旁效應(yīng)是指受照射細(xì)胞傳遞信號(hào)給未受照射細(xì)胞,從而使未受照射細(xì)胞發(fā)生一系列諸如基因表達(dá)改變[1-2]、基因突變[3-4]、DNA損傷[5-6]、細(xì)胞死亡[1,7]及惡性轉(zhuǎn)化[8]等的生物學(xué)改變。目前為止,大量體外[1,8]、體內(nèi)[9]證據(jù)證實(shí)了輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的存在。傳統(tǒng)的適應(yīng)性描述的是當(dāng)細(xì)胞先用一個(gè)小劑量照射后,再接受大劑量照射時(shí)變得具有抗性的現(xiàn)象,這個(gè)現(xiàn)象在體內(nèi)外均曾被觀察到[10-11]。

    近年來(lái)有證據(jù)顯示電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間可能存在關(guān)聯(lián)[12]。輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)細(xì)胞在受到大劑量照射時(shí)與適應(yīng)性現(xiàn)象中的細(xì)胞預(yù)先受過(guò)小劑量照射一樣變得具有抗性[13]。相反地,預(yù)先給予旁效應(yīng)細(xì)胞一個(gè)低劑量照射可使旁效應(yīng)不再出現(xiàn)[14]。然而這樣的關(guān)聯(lián)并非具有普適性。例如,研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)的H460和A549旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性反而增加了[15]。這些看似矛盾的結(jié)果表明深入研究旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間的關(guān)系將有助于對(duì)這些現(xiàn)象分子機(jī)制的理解。

    研究顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)可能在輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[16-17]。加入TGF-β1抑制劑之后,T98G細(xì)胞輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)現(xiàn)象(微核形成和細(xì)胞存活能力)消失了[16-17],提示受照射細(xì)胞釋放出的 TGF-β1信號(hào)因子可能作用于旁效應(yīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生自由基,從而導(dǎo)致 DNA損傷[16]。但是 TGF-β1是否也在適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用卻鮮有報(bào)道。另外,錳超氧化物歧化酶(SOD2)被發(fā)現(xiàn)參與了傳統(tǒng)適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生[18]。因此本研究以H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,研究輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)細(xì)胞是否存在適應(yīng)性的現(xiàn)象,并探討TGF-β1信號(hào)通路和SOD2在此過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑

    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;RPMI1640培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)和TGF-βR1抑制劑(SB431542)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;HEPES緩沖液購(gòu)自中國(guó)南京旋光科技有限公司;青霉素-鏈霉素、胰酶消化液和抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所;抗SOD2小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司;化學(xué)發(fā)光劑(ECL)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和輻照

    H1299細(xì)胞以適當(dāng)比例接種于含有10%胎牛血清、2.5g·L–1葡萄糖、1 mmol·L–1丙酮酸鈉、100 U·mL–1青霉素、100 μg·mL–1鏈霉素及 1 mmol·L–1HEPES (pH 7.2)的 RPMI1640培養(yǎng)液中,放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液。

    細(xì)胞在 20℃下采用美國(guó) RAD SOURCE RS2000 X-射線機(jī)進(jìn)行照射,能量為160 kVp,距離為40 cm,劑量率為1.16 Gy·min–1。用來(lái)提取照射條件培養(yǎng)液的細(xì)胞吸收劑量為5 Gy,用來(lái)研究輻射適應(yīng)性的吸收劑量為2 Gy。

    1.2.2 條件培養(yǎng)液的提取

    本文采用培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法獲得經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞。取100–120萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于100mm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后,更換新鮮的培養(yǎng)液并用X-射線照射,劑量為5 Gy。繼續(xù)培養(yǎng)1 h或18 h后,收集培養(yǎng)液并用無(wú)菌過(guò)濾器(Ф 0.22 μm)過(guò)濾以去除細(xì)胞碎片。為方便起見(jiàn),在本文中提供旁效應(yīng)信號(hào)的照射細(xì)胞被稱為信號(hào)細(xì)胞,接收條件培養(yǎng)液處理的未照射細(xì)胞被稱為旁效應(yīng)細(xì)胞。照射后1 h和18 h收集的條件培養(yǎng)液分別被稱為1 h照射條件培養(yǎng)液(1 h RCM)和 18 h照射條件培養(yǎng)液(18h RCM)。相對(duì)應(yīng)的未照射組被稱為未照射條件培養(yǎng)液(1 h SCM和18 h SCM)。另外,采用新鮮培養(yǎng)液作為空白對(duì)照(Control)。

    1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于60mm的培養(yǎng)皿中,每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞,每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行樣。24 h后,去除原培養(yǎng)液,分別更換為新鮮培養(yǎng)液、1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM,繼續(xù)培養(yǎng)13 d之后,棄培養(yǎng)液,用PBS快速洗3遍,甲醇固定15 min、亞甲基藍(lán)染色30 min,用清水將培養(yǎng)皿洗凈晾干。于顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落??寺⌒纬陕屎图?xì)胞克隆存活率按如下公式計(jì)算:克隆形成率(%) =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%;細(xì)胞克隆存活率 =處理組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率。

    1.2.4 Western Blotting檢測(cè)旁效應(yīng)細(xì)胞的SOD2表達(dá)水平

    旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM培養(yǎng)3 h或5 h后,用預(yù)冷的PBS溶液沖洗 3遍,加入適量細(xì)胞裂解液(0.1%曲拉通X-100、10 mmol·L–1Tris (pH 7.4)、10%甘油、150 mmol·L–1氯化鈉、5 mmol·L–1EDTA、1 mmol·L–1原釩酸鈉、1 mmol·L–1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 0.1%蛋白酶抑制劑),在4 ℃裂解30 min后,13000×g 4 ℃離心10 min,取上清,并用Bradford蛋白定量方法測(cè)定蛋白濃度。取適量樣品并加入 1/4體積的5×SDS-PAGE上樣緩沖液,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。然后用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(200 V, 30-60 min)。等到蛋白分離完成后,將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜(100 mA, 2 h)。膜用含5%脫脂奶粉的 TBST(100 mmol·L–1Tris-HCl/pH7.5, 0.9% NaCl,0.1% Tween-20)進(jìn)行非特異性封閉。加入抗 SOD2小鼠單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜,膜用TBST溶液清洗3遍,加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)室溫孵育45 min。膜用TBST清洗3遍,加入化學(xué)發(fā)光劑(ECL),用多功能激光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)Amersham公司Typhoon 9410)進(jìn)行曝光成像。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)都是至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均,并用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(±s)。采用Origin 8.0軟件的 Student’s T檢驗(yàn)進(jìn)行組與組間的比較分析,p<0.05被認(rèn)為兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各條件培養(yǎng)液對(duì)旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率無(wú)影響

    本研究采用培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移的方法,檢測(cè)了X-射線誘導(dǎo) H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆形成能力的改變情況。如圖1所示,與正常對(duì)照組相比,1 h 和18 h收集的未照射條件培養(yǎng)液并未改變旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆形成能力,且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的照射條件培養(yǎng)液也未改變旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率,提示X-射線不能誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞克隆能力的改變。

    2.2 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞對(duì)X-射線照射出現(xiàn)適應(yīng)性

    本研究探討了用照射和未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞,經(jīng)2 Gy的X-射線照射后,其細(xì)胞克隆存活率的改變情況。如圖2a所示,與未受照射細(xì)胞相比,H1299細(xì)胞直接接受2 Gy照射后其克隆存活率降低了14% (p<0.01);但如果細(xì)胞先在培養(yǎng)過(guò)未受照射 H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(1 h SCM)中培養(yǎng)24 h后再接受照射,其克隆存活率與未受照細(xì)胞相比只降低了4% (p=0.085),與直接照射細(xì)胞相比卻增加了12% (p<0.01);而細(xì)胞如果先在培養(yǎng)過(guò)受照 H1299細(xì)胞的照射條件培養(yǎng)液(1 h RCM)中培養(yǎng)24 h后再接受照射,其克隆存活率竟超過(guò)了未受照射細(xì)胞,增加了約5% (p=0.068),與直接照射細(xì)胞相比增加了22% (p=0.012)。并且,用長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)未受照和受照H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(18 h SCM和18 h RCM)培養(yǎng)后再接受照射,細(xì)胞的克隆存活率進(jìn)一步增加,與未受照細(xì)胞相比,分別增加了20%和31%,比直接照射細(xì)胞分別增加了38%和 52%(圖 2b)。有意思的是,無(wú)論照后 1 h還是18 h收集的條件培養(yǎng)液,RCM培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞與 SCM 培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞相比,其受照后克隆存活率都約高10%。這些結(jié)果提示H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后出現(xiàn)了對(duì)輻射的適應(yīng)性,而照射條件培養(yǎng)液進(jìn)一步增加了這種適應(yīng)性,并且該適應(yīng)性的大小與收集條件培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)。

    圖1 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)液(1 h SCM、1 h RCM、18 h SCM或18 h RCM)培養(yǎng)后的克隆存活率Fig.1 The clonogenic cell survival of H1299 unirradiated bystander cells cultured in SCM or RCM harvested at 1 h or 18h post-irradiation

    圖2 接受不同處理的H1299細(xì)胞受照后的克隆存活能力:(a) 1 h 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加照2 Gy;(b) 18 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加照2 Gy(*代表兩組相比,p<0.05)Fig.2 The survival fraction of H1299 bystander cells irradiated with 2 Gy X-rays after cultured in 1 h conditioned medium (a)or 18 h conditioned medium (b) for 24 h (*p<0.05 vs. relative controls)

    2.3 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性與 TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)

    為了探討 TGF-β1信號(hào)通路是否參與了輻射誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性,我們?cè)谡丈淝坝?10 μmol·L–1TGF-βR1 抑制劑(SB431542)預(yù)處理信號(hào)細(xì)胞1 h或收集條件培養(yǎng)液后直接將SB431542加入到條件培養(yǎng)液中,然后用與上述相同的方法培養(yǎng)旁效應(yīng)細(xì)胞,觀察SB431542對(duì)輻射誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞輻射適應(yīng)性的影響。10 μmol·L–1的SB431542對(duì)H1299細(xì)胞的短期增殖和長(zhǎng)期克隆形成均無(wú)顯著影響,SB431542聯(lián)合2 Gy照射與單獨(dú)照射相比,也未造成克隆形成率的顯著降低(未發(fā)表數(shù)據(jù))。圖3顯示,當(dāng)信號(hào)細(xì)胞在照前用SB431542預(yù)處理1 h后,1 h SCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射,其克隆存活率比直接照射組低7% (p=0.34),比未加SB431542組降低了20% (p =0.02);1 h RCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射,其克隆存活率比直接照射組低11% (p=0.03),比未加SB431542組降低了32% (p<0.01)。SCM組與RCM組間無(wú)顯著性差異;而用18 h SCM和18 h RCM培養(yǎng)過(guò)的旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射,其克隆率與直接照射組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,卻比未加 SB431542組分別降低了 19%和30%,并且SCM組和RCM組間也沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果顯示當(dāng)用SB431542抑制了信號(hào)細(xì)胞中的TGF-β1通路后,條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性消失了。另一方面,當(dāng) SB431542直接加到條件培養(yǎng)液中后,1 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后,其克隆率仍較直接照射組高,與未加SB431542組無(wú)顯著差異,并且 SCM 和 RCM 組間仍有 13%的差異,顯示用SB431542抑制旁效應(yīng)細(xì)胞自身的TGF-β1通路并不影響1 h條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性;然而,用含有SB431542的18 h SCM和18 h RCM培養(yǎng)過(guò)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后,其克隆存活率較未加 SB431542組分別降低了 28%和18%,18 h SCM組甚至降至直接照射組水平,但是18 h SCM組和18 h RCM組間差異增大至24%,提示用SB431542抑制旁效應(yīng)細(xì)胞自身的TGF-β1通路消除了未照射條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性,但卻增加了照射條件培養(yǎng)液和未照射條件培養(yǎng)液之間的差異。所有這些結(jié)果表明信號(hào)細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞中的TGF-β1信號(hào)通路對(duì)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性有著重要的調(diào)控作用。

    圖3 TGF-βR1抑制劑(SB431542)對(duì)X-射線誘導(dǎo)H1299旁效應(yīng)細(xì)胞輻射適應(yīng)性的影響(*代表兩組相比,p<0.05)Fig.3 The effects of SB431542 on the radiation adaptive response in bystander cells after cultured in conditioned medium harvested at 1 h and 18 h post-irradiation

    2.4 照射條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平下降

    我們通過(guò)western blotting檢測(cè)了各條件培養(yǎng)液培養(yǎng)旁效應(yīng)細(xì)胞3 h和5 h后細(xì)胞中SOD2的表達(dá)情況。如圖4所示,1 h RCM培養(yǎng)3 h和5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2的表達(dá)水平均降低了;18 h RCM培養(yǎng)3 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變,但是培養(yǎng)5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞SOD2表達(dá)水平發(fā)生了明顯的下降。

    圖4 采用Western Blotting 檢測(cè)各條件培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h和5 h后,H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平改變情況Fig.4 The alterations of SOD2 expression in bystander cells cultured in conditioned medium harvested at different times post-irradiation for 3 h and 5 h, respectively, which was determined by Western Blotting

    3 討論

    本研究證實(shí)雖然 X-射線不能影響 H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活能力,卻可以降低旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性,即旁效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)了輻射適應(yīng)性。具體表現(xiàn)為與未照射培養(yǎng)液和未處理細(xì)胞相比,在照后1 h或18 h 收集的照射條件培養(yǎng)液均不能改變H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的克隆存活率(圖1)。然而有趣的是,旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后加照2 Gy,其克隆存活率竟比單獨(dú)照射組的高(圖2),提示未照射條件培養(yǎng)液可在H1299細(xì)胞中誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng),換句話說(shuō),H1299細(xì)胞自身就可釋放某種信號(hào)因子給接收細(xì)胞使其產(chǎn)生輻射抗性;旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后加照2 Gy,其克隆存活率不僅較單獨(dú)照射組高,并且顯著高于未照射條件培養(yǎng)液組(圖2),表明X-射線誘導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)了適應(yīng)性反應(yīng),也即是X-射線誘導(dǎo)受照細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)因子,從而使旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射敏感性降低。這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的結(jié)果不一致,該研究顯示與接受未照射培養(yǎng)液處理后加照2 Gy的細(xì)胞相比,H460和A549細(xì)胞在接受其照射條件培養(yǎng)液處理后加照2 Gy,其克隆存活率顯著降低,即旁效應(yīng)細(xì)胞未發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)。巧合的是H460細(xì)胞和A549細(xì)胞剛好都具有野生型的tp53,而H1299細(xì)胞的tp53是突變型的。tp53是否在輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性中發(fā)揮某種作用需要進(jìn)一步研究。這些結(jié)果與傳統(tǒng)的適應(yīng)性反應(yīng)不相同,有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的適應(yīng)性反應(yīng)發(fā)生在野生型tp53的細(xì)胞中,而不發(fā)生在突變型tp53的細(xì)胞中[20]。這些提示旁效應(yīng)細(xì)胞的輻射適應(yīng)性與傳統(tǒng)的輻射適應(yīng)性可能不同。另外令人驚訝的是,旁效應(yīng)細(xì)胞接受2 Gy的X-射線照射后,其克隆形成率居然大于未處理細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),H1299細(xì)胞含有81.3%的CD44陽(yáng)性細(xì)胞,而這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多能性和間質(zhì)轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物,具有干細(xì)胞的自我更新和分化潛能的特點(diǎn),成瘤效率較CD44陰性細(xì)胞高,對(duì)順鉑具有抗性,并且長(zhǎng)期的順鉑處理將導(dǎo)致 CD44+細(xì)胞的比例增加到96.2%[21];另一方面,2 Gy的γ-射線照射可以促進(jìn)異質(zhì)非干細(xì)胞腫瘤細(xì)胞群中腫瘤干細(xì)胞的形成[22]。因此我們推測(cè)所觀察到的克隆形成率增加的原因可能是在此條件下,2 Gy的X-射線照射增加了旁效應(yīng)H1299細(xì)胞中CD44陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。該推測(cè)需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    我們已有的數(shù)據(jù)證實(shí) X-射線在 H1299細(xì)胞中誘導(dǎo)的旁效應(yīng)產(chǎn)生過(guò)程中,受照信號(hào)細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1信號(hào)通路都被激活,并且對(duì)旁效應(yīng)的各個(gè)終點(diǎn)(DNA損傷、ROS水平及細(xì)胞增殖等)的產(chǎn)生發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究顯示 TGF-β1信號(hào)通路對(duì)輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)起著復(fù)雜的作用。當(dāng)信號(hào)細(xì)胞的TGF-β1信號(hào)通路被抑制后,條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性不再產(chǎn)生,輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性也消失了。這些結(jié)果表明信號(hào)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路對(duì)旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生起著非常關(guān)鍵的作用。這些結(jié)果提示所觀察到的適應(yīng)性反應(yīng)的確是由旁效應(yīng)介導(dǎo)的,所以一旦通過(guò)抑制信號(hào)細(xì)胞的 TGF-β1通路來(lái)抑制旁效應(yīng)后,旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性就不再發(fā)生了。另一方面,當(dāng)旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1通路被抑制后,1 h收集的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性仍然存在,而18 h收集的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性都降低了,但照射條件培養(yǎng)液與未照射條件培養(yǎng)液之間的差異卻增大了,提示旁效應(yīng)細(xì)胞的 TGF-β1通路在不同時(shí)間點(diǎn)提取的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮的作用不相同,并且可能還有別的關(guān)鍵通路參與了旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)這一過(guò)程。這些結(jié)果提示旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性與傳統(tǒng)適應(yīng)性可能源于不同的機(jī)制,因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)適應(yīng)性的發(fā)生與TGF-β無(wú)關(guān)[23]。

    表明輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性與傳統(tǒng)的適應(yīng)性不同的另一個(gè)證據(jù)是旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2的表達(dá)。在傳統(tǒng)適應(yīng)性反應(yīng)中,低劑量電離輻射預(yù)處理細(xì)胞后導(dǎo)致SOD2表達(dá)上升[18],從而介導(dǎo)了適應(yīng)性的發(fā)生;但本研究發(fā)現(xiàn)旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)照射條件培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h 或5 h后,其胞內(nèi)SOD2表達(dá)水平卻下降了。我們已有的數(shù)據(jù)顯示 1 h RCM 可以引起H1299旁效應(yīng)細(xì)胞的miR-21表達(dá)增加,18 h RCM卻導(dǎo)致H1299旁效應(yīng)細(xì)胞miR-21表達(dá)下降(未發(fā)表數(shù)據(jù))。而 miR-21可以通過(guò) TNF-α間接調(diào)控SOD2[19]。因此miR-21表達(dá)的變化可能是本研究觀察到的 SOD2表達(dá)下降的一個(gè)主要原因。但 1 h RCM和18 h RCM引起H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中miR-21不同的改變,卻都引起了SOD2表達(dá)的降低,其中一個(gè)可能的解釋是因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同導(dǎo)致的,另一個(gè)可能的解釋是SOD2還有別的調(diào)控機(jī)制。這些結(jié)果提示,SOD2可能未參與輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生,但這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的直接證據(jù)。

    總之,本研究證實(shí)了電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)和適應(yīng)性之間存在關(guān)聯(lián)。伴隨著H1299旁效應(yīng)細(xì)胞中SOD2表達(dá)水平的下降,X-射線誘導(dǎo)的H1299旁效應(yīng)細(xì)胞受照后發(fā)生了適應(yīng)性反應(yīng);并且該適應(yīng)性的發(fā)生依賴于信號(hào)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路,而旁效應(yīng)細(xì)胞中的 TGF-β1信號(hào)通路發(fā)揮的作用比較復(fù)雜,與照后收集條件培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)。研究結(jié)果還顯示電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)信號(hào)可作為一個(gè)類似小劑量照射的傳統(tǒng)適應(yīng)性中的誘導(dǎo)劑,但輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞的適應(yīng)性卻不同于傳統(tǒng)適應(yīng)性,表現(xiàn)為SOD2和 TGF-β1信號(hào)通路在兩種現(xiàn)象中的調(diào)控作用不同。

    1 Yang H, Asaad N, Held K D. Medium-mediated intercellular communication is involved in bystander responses of X-ray irradiated normal human fibroblasts[J]. Oncogene, 2005, 24(12): 2096-2103.

    2 Azzam E I, De Toledo S M, Spitz D R, et al. Oxidative metabolism modulates signal transduction and micronucleus formation in bystander cells from alpha-particle-irradiated normal human fibroblast cultures[J]. Cancer Research, 2002, 62(19): 5436-5442.

    3 Nagasawa H, Huo L, Little J B. Increased bystander mutagenic effect in DNA double-strand break repair-deficient mammalian cells [J]. International Journal of Radiation Biology, 2003, 79(1): 35-41.

    4 Zhou H, Randers-Pehrsong, Waldren C A, et al.Induction of a bystander mutagenic effect of alpha particles in mammalian cells [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(5): 2099-2104.

    5 Azzam E l, De Toledo S M, Little J B. Direct evidence for the participation of gap junction-mediated intercellular communication in the transmission of damage signals from alpha-particle irradiated to nonirradiated cells [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(2): 473-478.

    6 Little J B. Genomic instability and bystander effects: a historical perspective [J]. Oncogene, 2003, 22(45):6978-6987.

    7 Lyng F M, Seymour C B, Mothersill C E. Initiation of apoptosis in cells exposed to medium from the progeny of irradiated cells: a possible mechanism for bystander induced genomic instability [J]. Radiation Research, 2002,157(4): 365-370.

    8 Sawant Sg, Randers-Pehrsong, Geard C R, et al. The bystander effect in radiation oncogenesis: I.transformation in C3H l0T cells in vitro can be initiated in the unirradiated neighbors of irradiated cells [J].Radiation Research, 2001, 155(3): 397-401.

    9 Jain M R, Li M, Chen W, et al. In vivo space radiation-induced non-targeted responses: late effects on molecular signaling in mitochondria [J]. Current Molecular Pharmacology, 2011, 4(2): 106-114.

    10 Olivierig, Bodycote J, Wolff S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. Science, 1984, 223(4636): 594-597.

    11 Wolff S. Is radiation all bad? The search for adaptation [J].Radiation Research, 1992, 131(2): 117-123.

    12 Zhou H, Randers-Pehrsong, Waldren C A, et al.Radiation-induced bystander effect and adaptive response in mammalian cells [J]. Advances in Space Research,2004, 34(6): 1368-1372.

    13 Maguire P, Mothersill C, McClean B, et al. Modulation of radiation responses by pre-exposure to irradiated cell conditioned medium [J]. Radiation Research, 2007,167(4): 485-492.

    14 Zhou H, Randers-Pehrsong, Geard C R, et al. Interaction between radiation-induced adaptive response and bystander mutagenesis in mammalian cells [J]. Radiation Research, 2003, 160(5): 512-516.

    15 Shareef M M, Cui N, Burikhanov R, et al. Role of tumor necrosis factor-A and TRAIL in high-dose radiationinduced bystander signaling in lung adenocarcinoma [J].Cancer Research, 2007, 67(24): 11811-11820.

    16 Shao C, Folkard M, Prise K M. Role of TGF-beta1 and nitric oxide in the bystander response of irradiated glioma cells [J]. Oncogene, 2008, 27(4): 434-440.

    17 Gow M D, Seymour C B, Ryan L A, et al. Induction of bystander response in human glioma cells using high-energy electrons: a role for TGF-beta1 [J]. Radiation Research, 2010, 173(6): 769-778.

    18 Guog, Yan-Sanders Y, Lyn-Cook B D, et al. Manganese superoxide dismutase- mediated gene expression in radiation-induced adaptive responses [J]. Molecular and Cellular Biology, 2003, 23(7): 2362-2378.

    19 Zhang X, Ng W L, Wang P, et al. MicroRNA-21 Modulates the Levels of Reactive Oxygen Species by Targeting SOD3 and TNFα [J]. Cancer Research, 2012,72(18): 4707-4713.

    20 Takahashi A, Su X, Suzuki H, et al. p53-dependent adaptive responses in human cells exposed to space radiations [J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, 2010, 78(4): 1171-1176.

    21 Leung E L, Fiscus R R, Tung J W, et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties [J]. PLoS One, 2010, 5(11): e14062.

    22 Ghisolfi L, Keates A C, Hu X, et al. Ionizing Radiation Induces Stemness in Cancer Cells [J]. PLoS ONE, 2012,7(8): e43628.

    23 Dieriks B, De Vos W, Baatout S, et al. Repeated exposure of human fibroblasts to ionizing radiation reveals an adaptive response that is not mediated by interleukin-6 or TGF-β [J]. Mutation Research, 2011, 715(1-2): 19-24.

    猜你喜歡
    培養(yǎng)液適應(yīng)性存活率
    谷子引種適應(yīng)性鑒定與篩選初報(bào)
    從一道試題再說(shuō)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用
    園林綠化施工中如何提高植樹(shù)存活率
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬(wàn)噸的魚(yú)要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬(wàn)斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    健全現(xiàn)代金融體系的適應(yīng)性之“點(diǎn)論”
    調(diào)整蔗糖、硼酸和pH值可優(yōu)化甜櫻桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)液
    不同培養(yǎng)液對(duì)大草履蟲(chóng)生長(zhǎng)與形態(tài)的影響研究
    大型飛機(jī)A380-800在既有跑道起降的適應(yīng)性研究
    超級(jí)培養(yǎng)液
    69av精品久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产男靠女视频免费网站| 99久久成人亚洲精品观看| av在线天堂中文字幕| 午夜福利高清视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲美女视频黄频| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美在线乱码| 国产美女午夜福利| 夜夜爽天天搞| 长腿黑丝高跟| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本黄大片高清| 免费看光身美女| 精品久久久久久久久久免费视频| a在线观看视频网站| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜影院日韩av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一本一本综合久久| 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品福利观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99久久精品国产亚洲精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一区二区三区不卡视频| 搞女人的毛片| 99久久九九国产精品国产免费| 最近最新中文字幕大全电影3| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩乱码在线| 国产91精品成人一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 国产精品99久久久久久久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久久久久久免 | 成人一区二区视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 一本一本综合久久| 亚洲精华国产精华精| 亚洲无线在线观看| 丰满的人妻完整版| 91av网一区二区| 91字幕亚洲| 黄色日韩在线| 国产伦在线观看视频一区| xxx96com| 国产久久久一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 99riav亚洲国产免费| 一夜夜www| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 18禁国产床啪视频网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文亚洲av片在线观看爽| 内射极品少妇av片p| 国产成人av激情在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 老鸭窝网址在线观看| 国产成年人精品一区二区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲中文字幕日韩| 内射极品少妇av片p| 窝窝影院91人妻| 国产在视频线在精品| 成人18禁在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美高清成人免费视频www| xxx96com| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精品久久国产高清桃花| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品乱码久久久久久99久播| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品在线美女| 国产毛片a区久久久久| 脱女人内裤的视频| 少妇的丰满在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av免费在线观看| www日本黄色视频网| 亚洲中文字幕日韩| 内射极品少妇av片p| 国产久久久一区二区三区| 成人av在线播放网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av五月六月丁香网| 一区二区三区国产精品乱码| 女人被狂操c到高潮| 精品熟女少妇八av免费久了| 中国美女看黄片| 免费观看人在逋| 五月玫瑰六月丁香| 男人舔女人下体高潮全视频| 一区二区三区激情视频| 少妇高潮的动态图| 亚洲成av人片在线播放无| 在线播放国产精品三级| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜亚洲福利在线播放| 极品教师在线免费播放| 国产一区二区在线av高清观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 久久久久性生活片| 中文在线观看免费www的网站| 久久精品国产综合久久久| 成人av一区二区三区在线看| 嫩草影视91久久| 国产高潮美女av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产伦一二天堂av在线观看| 麻豆一二三区av精品| 日本一本二区三区精品| 99久久综合精品五月天人人| 两人在一起打扑克的视频| 一本一本综合久久| 十八禁人妻一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 九九热线精品视视频播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产色爽女视频免费观看| 毛片女人毛片| а√天堂www在线а√下载| 亚洲国产欧美人成| 亚洲av成人av| av国产免费在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产免费一级a男人的天堂| av天堂中文字幕网| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲av五月六月丁香网| 99久久九九国产精品国产免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美+日韩+精品| netflix在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 在线观看舔阴道视频| 国产av麻豆久久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久人妻av系列| 最新美女视频免费是黄的| 天堂影院成人在线观看| 日本三级黄在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲avbb在线观看| 人妻久久中文字幕网| 欧美一级毛片孕妇| 国产69精品久久久久777片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲国产精品999在线| 国产野战对白在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 美女黄网站色视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品三级大全| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美免费精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产黄色小视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 欧美黑人巨大hd| 中国美女看黄片| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产中年淑女户外野战色| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品无人区乱码1区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产亚洲欧美98| www国产在线视频色| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 九色国产91popny在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品99久久99久久久不卡| 全区人妻精品视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 最新中文字幕久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 香蕉丝袜av| 亚洲性夜色夜夜综合| av视频在线观看入口| 亚洲七黄色美女视频| 中国美女看黄片| 十八禁人妻一区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| x7x7x7水蜜桃| bbb黄色大片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲一区二区三区不卡视频| 91九色精品人成在线观看| 熟女电影av网| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲片人在线观看| 亚洲,欧美精品.| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 黄色视频,在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 97超视频在线观看视频| 国产高清视频在线观看网站| 久久精品国产自在天天线| 免费电影在线观看免费观看| 长腿黑丝高跟| 亚洲av美国av| 精品一区二区三区视频在线 | 黄色丝袜av网址大全| 国产69精品久久久久777片| 久久久久国内视频| 一级黄片播放器| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产色婷婷99| www日本在线高清视频| 精品一区二区三区人妻视频| 美女免费视频网站| 亚洲av美国av| 国产伦人伦偷精品视频| 久久性视频一级片| aaaaa片日本免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av五月六月丁香网| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲,欧美精品.| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 色视频www国产| 久久久精品大字幕| 九色国产91popny在线| 亚洲午夜理论影院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国内精品一区二区在线观看| 久久人妻av系列| 欧美高清成人免费视频www| 一级毛片高清免费大全| 国产在线精品亚洲第一网站| 香蕉久久夜色| 真人做人爱边吃奶动态| 国产久久久一区二区三区| 草草在线视频免费看| 亚洲av二区三区四区| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲不卡免费看| 俺也久久电影网| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 身体一侧抽搐| 激情在线观看视频在线高清| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美日本视频| 在线a可以看的网站| 欧美日韩精品网址| 特级一级黄色大片| 天天一区二区日本电影三级| 久久香蕉精品热| 日本黄色视频三级网站网址| 国产极品精品免费视频能看的| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产老妇女一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲第一电影网av| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品福利观看| 内射极品少妇av片p| 9191精品国产免费久久| 男女那种视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产野战对白在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 成人三级黄色视频| 久久久久久人人人人人| 国产高潮美女av| 成人av一区二区三区在线看| 国产野战对白在线观看| 色在线成人网| 变态另类丝袜制服| 免费大片18禁| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品久久久久久久久久久久久| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 成人欧美大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 757午夜福利合集在线观看| 欧美区成人在线视频| 1000部很黄的大片| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久国内视频| 一级作爱视频免费观看| 免费在线观看成人毛片| 一级毛片高清免费大全| 免费无遮挡裸体视频| 身体一侧抽搐| 国产三级中文精品| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩欧美三级三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费看美女性在线毛片视频| 无人区码免费观看不卡| 久久久国产成人精品二区| 国产精品久久电影中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 丝袜美腿在线中文| 欧美一级毛片孕妇| 欧美大码av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色老头精品视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品影院6| 国产三级黄色录像| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩亚洲欧美综合| 国产成人av激情在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 老汉色∧v一级毛片| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲国产欧美人成| 欧美性猛交黑人性爽| 狠狠狠狠99中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线播放无遮挡| 激情在线观看视频在线高清| 全区人妻精品视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产一区二区激情短视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲激情在线av| 国产精品免费一区二区三区在线| 草草在线视频免费看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 男女午夜视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲色图av天堂| av国产免费在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲五月天丁香| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人18禁在线播放| 一个人看视频在线观看www免费 | av在线蜜桃| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费人成视频x8x8入口观看| 女警被强在线播放| 级片在线观看| 日本熟妇午夜| av国产免费在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜福利成人在线免费观看| 国产午夜精品论理片| 两个人的视频大全免费| 手机成人av网站| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产精品sss在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一夜夜www| 男插女下体视频免费在线播放| 51国产日韩欧美| 婷婷丁香在线五月| 99精品在免费线老司机午夜| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品,欧美在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 女警被强在线播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 最好的美女福利视频网| 国产精品av视频在线免费观看| a在线观看视频网站| e午夜精品久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美+日韩+精品| 老司机在亚洲福利影院| 婷婷六月久久综合丁香| 黄色视频,在线免费观看| 性色avwww在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产精品999在线| 国内精品美女久久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 一本综合久久免费| 亚洲在线自拍视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 免费人成视频x8x8入口观看| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产在视频线在精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲黑人精品在线| 国产伦人伦偷精品视频| 国产91精品成人一区二区三区| 美女大奶头视频| 精品国产三级普通话版| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲内射少妇av| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 岛国在线免费视频观看| 亚洲最大成人手机在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产 一区 欧美 日韩| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩大尺度精品在线看网址| 99国产精品一区二区三区| h日本视频在线播放| 国产午夜福利久久久久久| 国产成人系列免费观看| 国产成人福利小说| 午夜老司机福利剧场| 国内精品久久久久精免费| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲18禁久久av| 午夜福利在线观看吧| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影 | 搡老岳熟女国产| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产日本99.免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久人人精品亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人av激情在线播放| 国产精品综合久久久久久久免费| 波多野结衣高清作品| 成人鲁丝片一二三区免费| 18+在线观看网站| 久久久久久九九精品二区国产| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av第一区精品v没综合| bbb黄色大片| 国产精品女同一区二区软件 | 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆国产av国片精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 悠悠久久av| 日韩精品中文字幕看吧| 1000部很黄的大片| 国产av不卡久久| 青草久久国产| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产精品999在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| svipshipincom国产片| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美午夜高清在线| av片东京热男人的天堂| 免费av观看视频| 香蕉av资源在线| 夜夜爽天天搞| 99久久综合精品五月天人人| 日本三级黄在线观看| 国产午夜精品论理片| 久久久久亚洲av毛片大全| 婷婷六月久久综合丁香| 热99re8久久精品国产| 免费人成在线观看视频色| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 好男人电影高清在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产高清有码在线观看视频| 在线看三级毛片| 真人做人爱边吃奶动态| 国产午夜精品论理片| 国产免费av片在线观看野外av| 国产伦人伦偷精品视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产99白浆流出| 免费高清视频大片| 成人性生交大片免费视频hd| av专区在线播放| 国产乱人视频| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 精品福利观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产精品综合久久久久久久免费| 99热只有精品国产| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕av在线有码专区| 美女大奶头视频| 老鸭窝网址在线观看| 一本精品99久久精品77| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美zozozo另类| 高清在线国产一区| 亚洲片人在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲av电影不卡..在线观看| 香蕉久久夜色| 国产一区在线观看成人免费| 久久精品影院6| 在线播放国产精品三级| 成年女人看的毛片在线观看| 色吧在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中文亚洲av片在线观看爽| 精华霜和精华液先用哪个| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 青草久久国产| 日本黄色片子视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 在线观看免费视频日本深夜| ponron亚洲| 高清日韩中文字幕在线| 极品教师在线免费播放| 国产真实乱freesex| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩欧美在线乱码| 三级国产精品欧美在线观看| eeuss影院久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩欧美在线乱码| 黄片小视频在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 国产探花极品一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品久久视频播放| 欧美日本视频| 热99在线观看视频| 精品欧美国产一区二区三| 一区二区三区国产精品乱码| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本免费a在线| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 9191精品国产免费久久| 丁香欧美五月| 午夜老司机福利剧场| 99精品在免费线老司机午夜| 国产亚洲av嫩草精品影院| 又黄又粗又硬又大视频| 男女之事视频高清在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 欧美成人a在线观看| 天堂网av新在线| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩欧美一区二区三区在线观看| а√天堂www在线а√下载| 亚洲国产中文字幕在线视频| 九九在线视频观看精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产高清videossex| 国产av在哪里看| 午夜激情欧美在线| 成年版毛片免费区| 欧美成人a在线观看| 在线观看舔阴道视频| 极品教师在线免费播放| 高清在线国产一区| 色吧在线观看| 久久精品综合一区二区三区|