• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外泌體—電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的另一種機制

    2014-09-28 01:51:54蔣友芹尹曉明田文倩王敬東楊紅英
    關(guān)鍵詞:微核電離輻射外泌體

    陳 纖 蔣友芹 尹曉明 田文倩 王敬東 楊紅英

    (蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123)

    電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)指受照射細(xì)胞周圍沒有受到照射的細(xì)胞表現(xiàn)出來的生物學(xué)效應(yīng)。已有大量研究證明了旁效應(yīng)的存在[1-4],但介導(dǎo)旁效應(yīng)的分子機制卻仍然不清楚。至今,已提出4種介導(dǎo)旁效應(yīng)的分子機制,包括細(xì)胞間縫隙連接、信號細(xì)胞膜上配體與旁效應(yīng)細(xì)胞膜上受體之間的相互作用、信號細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子或者生長因子與其在旁效應(yīng)細(xì)胞膜上受體之間的相互作用以及細(xì)胞受照后分泌的各種可溶性分子[5]。最近,有報道指出細(xì)胞受照后分泌的外泌體可能介導(dǎo)旁效應(yīng)[6]。外泌體是一類多種細(xì)胞均可分泌的膜結(jié)構(gòu)囊泡[7-8],直徑30-150nm,內(nèi)含蛋白質(zhì)、RNA和脂類,可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[9-11]。本研究以H460人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對象,檢測細(xì)胞受照后分泌外泌體的特性,探討外泌體是電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能的介導(dǎo)機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫;胎牛血清購自美國Hyclone公司;RPMI1640培養(yǎng)基、丙酮酸鈉和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自美國 Sigma-Aldrich公司;FM4-64熒光染料購自美國Invitrogen公司;青霉素-鏈霉素、抗HSP90小鼠單克隆抗體、抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)和 DiO熒光染料購自中國碧云天生物技術(shù)研究所;HEPES緩沖液購自中國Robiot公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和輻照條件

    H460細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、2.5g·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、100 U·mL-1青霉素-鏈霉素和1 mmol·L-1HEPES的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37 ℃培養(yǎng)。提取外泌體實驗中,為避免血清中外泌體的干擾,采用無血清培養(yǎng)基。

    采用美國RAD SOURCE RS2000 X-射線機照射,劑量率為1.16 Gy·min-1。

    1.2.2 收集條件培養(yǎng)液

    本研究采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法研究經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)[12]。細(xì)胞接種24 h后,更換新鮮培養(yǎng)液,接受 X-射線照射。在受照后 0到24 h內(nèi)不同時間點收集條件培養(yǎng)液,并通過濾膜(Ф0.22 μm)過濾以除去細(xì)胞碎片。為方便起見,文中未受照射和受照射的條件培養(yǎng)液分別用 SCM(Conditioned medium from sham-irradiated cells)和RCM(Conditioned medium from irradiated cells)表示。另外,采用新鮮培養(yǎng)液作為空白對照。

    1.2.3 微核形成實驗

    將對數(shù)生長期的3萬個H460細(xì)胞接種在帶無菌小圓玻片的六孔板中,培養(yǎng)24 h后,分別更換為新鮮培養(yǎng)液、條件培養(yǎng)液或者含外泌體的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)液,PBS快速洗滌2次,細(xì)胞用V甲醇: V乙酸=3:1固定10 min并風(fēng)干;細(xì)胞水化后用 DAPI (10 μg·mL-1)染色 2 min,PBS 洗滌后用抗熒光淬滅液封片。小圓玻片置于倒置熒光顯微鏡(DM2000, Leica, Germany)下進行細(xì)胞觀察、計數(shù)。含微核的細(xì)胞為陽性細(xì)胞,計數(shù)1000個細(xì)胞中陽性細(xì)胞的個數(shù)。

    1.2.4 細(xì)胞克隆形成實驗

    將對數(shù)生長期的H460細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中,100個細(xì)胞/皿,每組3皿,第二天分別更換為新鮮培養(yǎng)液、條件培養(yǎng)液或含外泌體的新鮮培養(yǎng)液在 37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)14 d。棄去培養(yǎng)基,用甲醇固定,亞甲基藍(lán)染色,鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。計算克隆形成率(%)和細(xì)胞克隆存活率:

    克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%;

    細(xì)胞克隆存活率=處理組克隆形成率/對照組克隆形成率。

    1.2.5 外泌體的分離與提純

    外泌體的分離和收集采用文獻[13]報道的方法。具體說來,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,20mL培養(yǎng)液培養(yǎng)1500萬細(xì)胞,首先用孔徑為0.22 μm的過濾器過濾,除去雜質(zhì)和懸浮細(xì)胞;然后進行差速離心,300g離心10 min,2,000g離心10 min,10,000g離心30 min,以除去細(xì)胞碎片;上清再經(jīng)100,000g離心70 min,獲得細(xì)胞分泌的外泌體;外泌體經(jīng) PBS清洗,100,000g離心70 min并去除上清后重懸于PBS中,分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩K须x心步驟均在4 ℃條件下進行。采用總蛋白定量方法定量外泌體:大約900萬細(xì)胞的條件培養(yǎng)液能提取1 μg外泌體。

    1.2.6 外泌體尺寸分析

    用馬爾文激光粒度儀 Zetasizer Nano ZS 90(Malvern, UK)測量提取的各組外泌體的尺寸分布。

    1.2.7 外泌體的透射電鏡鑒定

    取100 μL(約5 μg)新鮮提取的外泌體溶液,用2%戊二醛固定30 min。將外泌體滴于230目碳支持膜上,2%乙酸雙氧鈾染色5 min,風(fēng)干,透射電鏡(TEM, JEM-200 CX, Jeol. Ltd., Japan)下觀察。

    1.2.8 Western blotting檢測外泌體標(biāo)記物

    提取外泌體,用細(xì)胞裂解液(0.1%曲拉通X-100,10 mmol·L-1Tris (pH =7.4),10%甘油,150 mmol·L-1氯化鈉,5 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1原釩酸鈉,1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 0.1%蛋白酶抑制劑)在4 ℃裂解30 min,13000 r·min-14 ℃離心10 min后,吸取蛋白上清。用Bradford蛋白定量方法測定蛋白濃度,向樣品中加入 5×上樣緩沖液,95 ℃條件下,5 min使蛋白質(zhì)變性。然后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,膜用含 5%脫脂奶粉的 TBST緩沖液進行非特異性封閉,加入抗 HSP90小鼠單克隆抗體 4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次,加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)室溫孵育45 min。洗膜后,加入化學(xué)發(fā)光液,用多功能激光掃描成像系統(tǒng)(美國Amersham公司Typhoon 9410)進行掃描和圖像分析。

    1.2.9 外泌體與接收細(xì)胞的相互作用

    將對數(shù)生長期的 3 萬個 H460細(xì)胞接種在 35mm帶無菌小圓玻片的小皿內(nèi)。24 h后,細(xì)胞用濃度為 15 μg·mL-1的綠色細(xì)胞膜染料DiO在室溫下染色15 min,PBS洗滌兩次以去除未結(jié)合染料。同時,用濃度為 10 μg·mL-1的紅色細(xì)胞膜染料 FM 4-64 在37 ℃下孵育外泌體15 min后,PBS洗滌2次,洗掉未結(jié)合染料。然后將染色后的外泌體加入到染色后的細(xì)胞中于37 ℃培養(yǎng)30 min。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min后,用DAPI染色,加抗熒光淬滅液封片,于倒置熒光顯微鏡下觀察、攝片。

    1.2.10 細(xì)胞增殖實驗

    接種10,000個細(xì)胞于96孔板中,24 h后,更換新鮮培養(yǎng)液或含外泌體的新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,輕輕吸出培養(yǎng)液,PBS輕柔沖洗細(xì)胞,吸干后,用0.5%的結(jié)晶紫甲醇溶液室溫染色15 min,吸走結(jié)晶紫甲醇溶液,加入100 μL檸檬酸鈉 (pH =4.2)/50% 乙醇混合液震蕩30 min溶解結(jié)晶紫;用酶標(biāo)儀(BIO-TEK Power Wave XS, USA)檢測樣品在540nm處的吸光度值。以單純新鮮培養(yǎng)液組作為對照,對其它組樣品數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

    1.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

    本研究采用Origin 8軟件進行統(tǒng)計和作圖,采用的統(tǒng)計學(xué)方法為Student’s t-test,p<0.05時,認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均來源于獨立的至少重復(fù)3次的實驗結(jié)果,文中用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

    2 結(jié)果

    2.1 X-射線可在 H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)

    本研究采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法,探索了X-射線在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。如圖1所示,將 5 Gy X-射線照射后 18 h的條件培養(yǎng)液(RCM)轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞,旁效應(yīng)細(xì)胞的微核形成率相對于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉(zhuǎn)移組增加了 3.5-5倍,細(xì)胞克隆存活率降低了8.3%。這些結(jié)果表明X-射線可在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)由培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng);并且5 Gy X-射線照射后的條件培養(yǎng)液和10 Gy X-射線照射后的條件培養(yǎng)液在旁效應(yīng)細(xì)胞中產(chǎn)生的微核形成率之間的差異不具統(tǒng)計學(xué)意義,表明兩個不同劑量的電離輻射誘導(dǎo)相似的旁效應(yīng)。

    圖1 X-射線在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)由培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng): (a) H460旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未受照和受照射后18 h條件培養(yǎng)液(SCM和RCM)培養(yǎng)后的微核形成率;(b) H460旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未受照和受照射后18 h條件培養(yǎng)液(SCM和RCM)培養(yǎng)后的克隆存活率*與新鮮培養(yǎng)液和未受照條件培養(yǎng)液對照相比, p<0.05Fig.1 X-ray irradiation induced medium-mediated bystander effects: (a) the frequency of MN formation in unirradiated bystander H460 cells cultured in SCM or RCM harvested at 18 h post-irradiation; (b) The clonogenic cell survival of unirradiated bystander cells cultured in SCM or RCM harvested at 18 h post-irradiation*p<0.05, compared with fresh medium control and SCM control

    2.2 外泌體性質(zhì)鑒定

    已有大量文獻報道外泌體是細(xì)胞間信號傳遞的一種方式[9-11]。本研究探索了外泌體是否在電離輻射旁效應(yīng)中扮演著信號傳遞作用。首先分離外泌體,并鑒定其性質(zhì)。如圖 2a和2b所示,H460細(xì)胞不管是否受照,分泌的外泌體呈現(xiàn)典型的“盤杯狀”特征,大小在30-150nm之間。進一步通過Western Blotting檢測普遍接受的外泌體標(biāo)志物HSP 90 β,確證提取物為外泌體(如圖 2c)。有趣的是,不管是否受到照射,H460細(xì)胞均分泌外泌體。但是兩種外泌體的粒徑卻完全不同,從 SCM 中提取的外泌體粒徑分布在60-165nm,從RCM中提取的外泌體粒徑分布在30-70nm(如圖2d)。這些結(jié)果提示照射明顯改變了細(xì)胞分泌外泌體的性質(zhì)。未發(fā)表數(shù)據(jù)還顯示細(xì)胞分泌的外泌體尺寸還依賴于細(xì)胞所受劑量和照射后時間。

    圖2 從SCM和RCM中提取的外泌體性質(zhì)鑒定: (a)從SCM中提取的外泌體電鏡圖片; (b)從RCM中提取的外泌體電鏡圖片;(c) Western Blotting檢測外泌體標(biāo)志物Hsp 90 β; (d)從SCM和RCM中提取外泌體的粒徑分布Fig.2 Characterization of exosomes isolated from SCM and RCM: (a) TEM images of exosomes isolated from SCM;(b) TEM images of exosomes isolated from RCM; (c) Western blot analysis of protein marker (HSP 90β) of exosomes;(d) Size distribution of exosomes isolated from SCM and RCM

    2.3 外泌體與H460接收細(xì)胞之間的相互作用

    為了探索外泌體是介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)的一種可能方式,將從SCM和RCM中提取的外泌體加入到H460接收細(xì)胞中孵育30 min。在此之前,將外泌體用紅色膜熒光染料染色,而接收細(xì)胞用綠色膜熒光染料染色。結(jié)果如圖3a和3b所示,從SCM和RCM中提取的外泌體均能迅速進入H460接收細(xì)胞中,而且可能是通過膜融合的方式[14](圖中橙色代表紅色和綠色的共定位)。這提示外泌體可以作為未受照射或受照射H460細(xì)胞向接收細(xì)胞傳遞信號物質(zhì)的一種載體。

    圖3 從SCM(a)和RCM(b)中提取的外泌體進入接收細(xì)胞紅色:FM 4-64外泌體染色;綠色:DiO細(xì)胞膜染色;藍(lán)色:DAPI細(xì)胞核染色Fig.3 Internalization of exosomes isolated from SCM (a) and RCM (b) into the recipient cells:exosomes were labeled with FM 4-64 (red); cell membranes were labeled with DiO (green); nuclei were stained with DAPI (blue)

    2.4 從條件培養(yǎng)液提取的外泌體可誘導(dǎo)接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)

    為了確證外泌體是電離輻射在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種介導(dǎo)方式,將從SCM和RCM中提取的外泌體直接加入到H460接收細(xì)胞中。與對照相比,加入從 SCM 中提取的外泌體未改變接收細(xì)胞的微核形成率,而從RCM中提取的外泌體卻使接收細(xì)胞的微核形成率增加了兩倍(見圖 4a)。表明從受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取的外泌體與未照射條件下提取的外泌體性質(zhì)不同,前者可以在接收細(xì)胞中誘導(dǎo)生物學(xué)變化,提示外泌體是電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能機制。并且當(dāng)先用RNA酶在37 ℃與外泌體孵育90 min后,再將外泌體加入接收細(xì)胞,之前觀察到的從RCM中提取的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增加的生物學(xué)效應(yīng)消失了,表明外泌體中 RNA在其誘導(dǎo)微核形成增加中發(fā)揮著重要作用。然而,未發(fā)表數(shù)據(jù)顯示,不管是否受照,H460細(xì)胞分泌的外泌體均不改變接收細(xì)胞的克隆存活率,說明受照后條件培養(yǎng)液介導(dǎo)的克隆存活率降低可能并不是由外泌體介導(dǎo)的。另外,與新鮮培養(yǎng)液對照組相比,不管是否受照,H460細(xì)胞分泌的外泌體均能促進接收細(xì)胞的增殖(大約11%,見圖4b),這表明,不管是否受照,H460細(xì)胞分泌的外泌體均可能介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳遞,促進腫瘤細(xì)胞生長。

    圖4 從SCM和RCM中提取純化的外泌體對接收細(xì)胞微核形成的影響(a)和從SCM和RCM中提取純化的外泌體對接收細(xì)胞增殖的影響(b): *與新鮮培養(yǎng)液對照相比, p<0.05; **與新鮮培養(yǎng)液對照相比, p<0.01Fig.4 The frequency of MN formation in the recipient cells cultured in medium with exosomes isolated from SCM and RCM (a)and the cell proliferation of the recipient cells cultured in medium with exosomes isolated from SCM and RCM(b)* p<0.05, compared with fresh medium control; ** p<0.01, compared with fresh medium control

    3 討論

    本研究證實了電離輻射可在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)(見圖1),旁效應(yīng)細(xì)胞的微核形成增加,細(xì)胞克隆存活率降低,DNA損傷增加(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這與文獻報道的X-射線照射H460細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放,從而產(chǎn)生表現(xiàn)為細(xì)胞存活和凋亡改變的旁效應(yīng)相一致[15]。盡管文獻[15]提示電離輻射在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)的旁效應(yīng)可由腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體 TRAIL(TRAIL與促凋亡蛋白 PAR-4的核轉(zhuǎn)位有關(guān))介導(dǎo),本研究提供證據(jù)證實H460細(xì)胞受照后分泌的外泌體是誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能機制。

    多細(xì)胞體系中,細(xì)胞間通訊對于各種類型細(xì)胞的正常組織和功能必不可少。除了被廣為接受的細(xì)胞間通訊機制,例如細(xì)胞間隙連接、釋放的生長因子、化學(xué)因子和小分子包括多肽、離子、核酸和脂質(zhì)等,越來越多的證據(jù)表明外泌體-這種特殊的納米膜結(jié)構(gòu)囊泡,可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[16]。外泌體是一類直徑在30-150nm,可由多種細(xì)胞,包括各種腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和正常細(xì)胞釋放的囊泡[7-8]。外泌體包含豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多種核酸,特別是miRNAs和通常以蛋白質(zhì)復(fù)合體形式存在并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用的RNAs[10-11,16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),從未受照射和受照射細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中均可提取到外泌體(圖2),表明H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分泌外泌體既是組成型又是誘導(dǎo)型。這和之前的文獻報道有所不同,該報道顯示未受照H460細(xì)胞并不分泌可檢測的外泌體[18]。一個可能的原因是兩項研究中所用細(xì)胞培養(yǎng)條件和外泌體提取方法的不同。然而本研究發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞受照前后,其釋放的外泌體的尺寸分布不同,受照H460細(xì)胞釋放的外泌體比未受照細(xì)胞分泌的外泌體尺寸小(圖2)。細(xì)胞受照前后分泌的外泌體大小不同提示受照后外泌體成分可能發(fā)生了變化。未發(fā)表數(shù)據(jù)表明,受照射細(xì)胞分泌的外泌體尺寸分布與細(xì)胞所受劑量和照射后培養(yǎng)時間相關(guān),提示受照射細(xì)胞在不同劑量和不同培養(yǎng)時間情況下可能分泌不同的信號分子。

    從未受照射和受照射細(xì)胞的條件培養(yǎng)液提取的外泌體可以迅速進入接收細(xì)胞,可能是通過膜融合的方式[14],見圖3中橙色,由不同膜染料的紅色和綠色疊加形成,表明 H460細(xì)胞釋放的外泌體可以直接將信號分子傳遞進接收細(xì)胞。有趣的是,從受照射細(xì)胞條件培養(yǎng)液提取的外泌體顯著增加接收細(xì)胞的微核形成(圖4a)表明細(xì)胞受照后分泌的外泌體內(nèi)容物與未受照時不同。然而,不管受照射與否,H460細(xì)胞分泌的外泌體對接收細(xì)胞均有促增殖作用,兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖 4b)。這與文獻報道膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放外泌體促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖類似[9]。未發(fā)表數(shù)據(jù)顯示不管是否受照,H460細(xì)胞分泌的外泌體均不改變接收細(xì)胞的克隆存活率。這些結(jié)果提示,不管是否受照射,H460 細(xì)胞分泌的外泌體均含有促細(xì)胞生長因子,但這些細(xì)胞因子對H460細(xì)胞的克隆存活率沒有影響;并且,細(xì)胞受照后釋放的外泌體中含有誘導(dǎo)微核形成的因子,這可能是照射后轉(zhuǎn)移條件培養(yǎng)液導(dǎo)致旁效應(yīng)細(xì)胞微核增加的機制之一。受照細(xì)胞釋放的外泌體能增加接收細(xì)胞的微核形成,但不改變接收細(xì)胞的克隆存活率,這些結(jié)果提示導(dǎo)致電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的不同表現(xiàn)的機制可能不一樣。這與之前 Yang等[2]的報道相似,他們證實了活性氧淬滅劑可降低 X-射線在AG01522細(xì)胞中誘導(dǎo)的經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)DNA損傷,但卻對旁效應(yīng)細(xì)胞殺傷沒有影響,從而提示電離輻射誘導(dǎo)的不同旁效應(yīng)可能存在不同的機制。

    并且, RNA可能是受照細(xì)胞分泌的外泌體中重要的效應(yīng)分子,因為用RNase處理外泌體可消除其增加接收細(xì)胞微核形成的效應(yīng)(圖 4a)。這與之前文獻[6]報道外泌體中 RNA 介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)相一致。但是,在外泌體中加入RNase對接收細(xì)胞的增殖無影響(圖 4b)。這進一步提示,外泌體中的促微核形成因子和促細(xì)胞增殖因子并不相同。

    總之,本研究證實了X-射線照射H460細(xì)胞可誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng),表現(xiàn)為微核增加和克隆存活率下降。另一方面,H460細(xì)胞可分泌組成型和誘導(dǎo)型外泌體,受照細(xì)胞分泌的外泌體與未受照射細(xì)胞分泌的外泌體在尺寸分布上有很大不同,兩者都可通過膜融合的方式迅速進入接收細(xì)胞,從而促進接收細(xì)胞的增殖;并且,受照細(xì)胞分泌的外泌體可導(dǎo)致接收細(xì)胞的微核形成率增加,而 RNA酶可抑制這種增加;但是受照細(xì)胞分泌的外泌體不影響接收細(xì)胞的克隆存活率。這些結(jié)果表明外泌體是介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)的一種可能機制,其中 RNA發(fā)揮著重要作用。但是,未受照射和受照射細(xì)胞分泌的外泌體的蛋白質(zhì)和 RNA等成分構(gòu)成和引起接收細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的信號分子需要進一步研究。

    1 Zhou H, Suzuki M, Randers-Pehrsong, et al. Radiation risk to low fluences of alpha particles may be greater than we thought [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2001, 98: 14410-14415.

    2 Yang H, Asaad N, Held K D. Medium-mediated intercellular communication is involved in bystander responses of X-ray-irradiated normal human fibroblasts[J]. Oncogene, 2005, 24: 2096-2103.

    3 Shao C, Folkard M, Michael B D, et al. Targeted cytoplasmic irradiation induces bystander responses [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2004, 101: 13495-13500.

    4 Mancuso M, Pasquali E, Leonardi S, et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2008, 105: 12445-12450.

    5 Hamada N, Matsumoto H, Hara T, et al. Intercellular and intracellular signaling pathways mediating ionizing radiation-induced bystander effects [J]. Radiation Research, 2007, 48: 87-95.

    6 Al-Mayah A H, Irons S L, Pink R C, et al. Possible role of exosomes containing RNA in mediating nontargeted effect of ionizing radiation [J]. Radiation Research, 2012,177: 539-545.

    7 Théry C, Ostrowski M, Segura E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses [J]. Nature Reviews Immunology, 2009, 9: 581-593.

    8 Wolfers J, Lozier A, Raposog, et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming [J]. Nature Medicine, 2001, 7:297-303.

    9 Skog J, Würdinger T, Van Rijn S, et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers [J].Nature Cell Biology, 2008, 10: 1470-1476.

    10 Record M, Carayon K, Poirot M, et al. Exosomes as new vesicular lipid transporters involved in cell-cell communication and various pathophysiologies. [J].Biochimica et Biophysica Acta, 2013, 1841: 108-120.

    11 Valadi H, Ekstr?m K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells [J]. Nature Cell Biology, 2007, 9: 654-659.

    12 Lyng F M, Seymour C B, Mothersill C. Initiation of apoptosis in cells exposed to medium from the progeny of irradiated cells: a possible mechanism for bystander-induced genomic instability [J]. Radiation Research, 2002, 157: 365-370.

    13 Théry C, Clayton A, Amigorena S, et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids [J]. Current Protocols in Cell Biology, 2006, 3.22.1-3.22.29.

    14 Tian Y, Li S, Song J, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy [J]. Biomaterials,2014, 35(7): 2383-2390.

    15 Shareef M M, Cui N, Burikhanov R, et al. Role of tumor necrosis factor-alpha and TRAIL in high-dose radiation-induced bystander signaling in lung adenocarcinoma [J]. Cancer Research, 2007, 67:11811-11820.

    16 Mathivanan S, Ji H, Simpson R J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication [J].Journal of Proteomics, 2010, 73: 1907-1920.

    17 Mathivanan S, Fahner C J, Reidg E, et al. ExoCarta 2012:database of exosomal proteins, RNA and lipids [J].Nucleic Acids Research, 2012, 40: D1241-D1244.

    18 Yu X, Harris S L, Levine A J. The regulation of exosome secretion: a novel function of the p53 protein [J]. Cancer Research, 2006, 66: 4795-4801.

    猜你喜歡
    微核電離輻射外泌體
    外泌體miRNA在肝細(xì)胞癌中的研究進展
    間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在口腔組織再生中的研究進展
    一個控制超強電離輻射抗性開關(guān)基因的研究進展
    循環(huán)外泌體在心血管疾病中作用的研究進展
    外泌體在腫瘤中的研究進展
    汞、砷、甲醛單一及復(fù)合污染對蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響及污染評價
    Akt聯(lián)合電離輻射對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡、自噬和增殖的影響
    重金屬鉛、鎳對苦菜根尖細(xì)胞分裂的影響
    電離輻射促進食管鱗癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及遷移
    多細(xì)胞系胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗法的建立與應(yīng)用
    国产精品无大码| 久久99热这里只频精品6学生| 高清欧美精品videossex| 嘟嘟电影网在线观看| av专区在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 最黄视频免费看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久午夜福利片| 999精品在线视频| 秋霞伦理黄片| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人精品婷婷| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 丝瓜视频免费看黄片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品一区二区三区四区免费观看| av福利片在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品一二三区在线看| 国产淫语在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本vs欧美在线观看视频| 综合色丁香网| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩电影二区| 免费av不卡在线播放| 观看av在线不卡| 国产精品女同一区二区软件| 久久精品国产亚洲网站| kizo精华| 国产免费一级a男人的天堂| 日本av免费视频播放| 国产片内射在线| 曰老女人黄片| 香蕉精品网在线| 亚洲在久久综合| 婷婷色麻豆天堂久久| av播播在线观看一区| 精品久久国产蜜桃| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利视频在线观看免费| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产av新网站| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久久久久久久久久丰满| 国产成人一区二区在线| av播播在线观看一区| 国产精品女同一区二区软件| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品99久久久久久久久| 日韩伦理黄色片| 国产黄片视频在线免费观看| 国产一级毛片在线| 伦理电影大哥的女人| 亚洲精品日韩av片在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲五月色婷婷综合| 在线观看免费视频网站a站| 免费观看在线日韩| 91久久精品国产一区二区三区| 国产 精品1| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av福利片在线| videossex国产| 久久精品国产a三级三级三级| 九草在线视频观看| 精品久久久久久久久亚洲| 黄色怎么调成土黄色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲无线观看免费| av福利片在线| 日韩免费高清中文字幕av| av在线app专区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最新的欧美精品一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| 免费黄色在线免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产永久视频网站| 国产成人精品婷婷| 欧美3d第一页| 成人免费观看视频高清| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜老司机福利剧场| 十八禁高潮呻吟视频| 国产成人精品福利久久| 精品久久久久久电影网| 大片免费播放器 马上看| 欧美3d第一页| 精品国产露脸久久av麻豆| 草草在线视频免费看| 人人澡人人妻人| 国产精品久久久久久精品古装| 色5月婷婷丁香| 91国产中文字幕| 中国国产av一级| 成人二区视频| 免费av不卡在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久精品国产国产毛片| 天天影视国产精品| 只有这里有精品99| 色视频在线一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产男人的电影天堂91| 成人二区视频| av有码第一页| 五月玫瑰六月丁香| 人妻系列 视频| 伦精品一区二区三区| 男人操女人黄网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| av线在线观看网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| 97在线视频观看| 人妻系列 视频| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品乱久久久久久| a级毛色黄片| 一个人看视频在线观看www免费| 日本午夜av视频| 高清不卡的av网站| 久久久国产欧美日韩av| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久久久精品精品| 内地一区二区视频在线| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 一个人免费看片子| 免费人妻精品一区二区三区视频| 99久久综合免费| 精品人妻一区二区三区麻豆| 午夜日本视频在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 午夜福利视频在线观看免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品中文字幕在线视频| 色94色欧美一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品 国内视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 欧美精品一区二区大全| 久久久久久久精品精品| 国产免费又黄又爽又色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲不卡免费看| 欧美三级亚洲精品| 成人影院久久| tube8黄色片| 天天操日日干夜夜撸| 中国国产av一级| 丝瓜视频免费看黄片| 三级国产精品欧美在线观看| 色视频在线一区二区三区| 97在线人人人人妻| 日本免费在线观看一区| 精品少妇久久久久久888优播| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 天堂8中文在线网| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜激情久久久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲内射少妇av| 久久久精品区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 一级二级三级毛片免费看| 久久久久久人妻| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 成人免费观看视频高清| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久久久国产电影| 一级,二级,三级黄色视频| 视频中文字幕在线观看| 亚洲图色成人| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久99热这里只频精品6学生| 一个人免费看片子| 少妇丰满av| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产高清有码在线观看视频| 高清欧美精品videossex| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩一区二区视频免费看| 九九在线视频观看精品| 最新中文字幕久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 九色亚洲精品在线播放| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av二区三区四区| 亚洲天堂av无毛| 黑人高潮一二区| 好男人视频免费观看在线| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 一个人看视频在线观看www免费| 看非洲黑人一级黄片| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美精品亚洲一区二区| 尾随美女入室| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 好男人视频免费观看在线| 乱人伦中国视频| 黄色配什么色好看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲精品一区蜜桃| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 晚上一个人看的免费电影| 男女无遮挡免费网站观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品国产三级专区第一集| 国产一区亚洲一区在线观看| a级毛片黄视频| 国产高清三级在线| 黑丝袜美女国产一区| 免费高清在线观看视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产免费又黄又爽又色| 久久久久久伊人网av| 人妻系列 视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美激情 高清一区二区三区| 七月丁香在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲av不卡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品国产av在线观看| 成人国语在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 最新的欧美精品一区二区| av不卡在线播放| 成人免费观看视频高清| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲在久久综合| 国产亚洲欧美精品永久| 日本91视频免费播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品自拍成人| 九色亚洲精品在线播放| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 色94色欧美一区二区| 免费大片18禁| 国产不卡av网站在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁动态无遮挡网站| 人成视频在线观看免费观看| 老司机影院成人| 久久国产精品大桥未久av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产日韩欧美视频二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| av电影中文网址| 少妇高潮的动态图| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产男女内射视频| 免费看不卡的av| 欧美日韩在线观看h| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 熟女电影av网| 日韩免费高清中文字幕av| 五月开心婷婷网| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 热re99久久精品国产66热6| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品国产av成人精品| www.av在线官网国产| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人精品婷婷| 男女无遮挡免费网站观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品日本国产第一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99九九在线精品视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在线观看免费高清a一片| 熟女av电影| 免费av中文字幕在线| 日韩视频在线欧美| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久人妻综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 久久久精品区二区三区| 欧美精品一区二区免费开放| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av中文av极速乱| 成年人午夜在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 美女福利国产在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人av激情在线播放 | 日韩av免费高清视频| 91成人精品电影| 国产国语露脸激情在线看| 婷婷成人精品国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 最新中文字幕久久久久| 99热这里只有精品一区| 人人妻人人澡人人看| 丝袜在线中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 国产精品久久久久久精品古装| 日本与韩国留学比较| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜日本视频在线| 国产视频内射| 日本色播在线视频| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日日啪夜夜爽| 亚州av有码| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲欧洲国产日韩| 老熟女久久久| 美女国产视频在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 美女cb高潮喷水在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美精品自产自拍| 简卡轻食公司| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99热全是精品| 午夜av观看不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 中文欧美无线码| 亚洲欧美一区二区三区国产| av在线观看视频网站免费| 久久99热6这里只有精品| 久久免费观看电影| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品视频女| 午夜激情福利司机影院| 日本av免费视频播放| 国产精品久久久久久久久免| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品国产自在天天线| 成年av动漫网址| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品一区蜜桃| 五月玫瑰六月丁香| av视频免费观看在线观看| 国产片内射在线| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲综合色惰| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品人妻久久久影院| 欧美成人午夜免费资源| 欧美日韩在线观看h| 熟女人妻精品中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 天堂8中文在线网| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人成视频在线观看免费观看| 午夜激情久久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲av成人精品一二三区| 乱人伦中国视频| 日韩大片免费观看网站| 免费人成在线观看视频色| a级毛片免费高清观看在线播放| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品色激情综合| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久精品94久久精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 五月开心婷婷网| 99九九在线精品视频| 永久网站在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 飞空精品影院首页| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产高清三级在线| 丰满乱子伦码专区| 国产成人freesex在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| av有码第一页| av不卡在线播放| 久久热精品热| 999精品在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| videos熟女内射| 在线观看三级黄色| 国产精品不卡视频一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人精品在线电影| 国产片特级美女逼逼视频| a级毛片在线看网站| 久久精品久久久久久久性| 国产熟女午夜一区二区三区 | 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久欧美国产精品| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 有码 亚洲区| 欧美激情 高清一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 精品酒店卫生间| 美女福利国产在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久精品性色| 午夜av观看不卡| 九九爱精品视频在线观看| 亚州av有码| 99久久精品一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 大香蕉久久网| 婷婷色综合www| 亚洲av欧美aⅴ国产| 三级国产精品片| 五月伊人婷婷丁香| 精品亚洲成a人片在线观看| 少妇的逼好多水| 国产毛片在线视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲不卡免费看| 亚洲av福利一区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 精品国产国语对白av| 国产熟女欧美一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 久久99蜜桃精品久久| 99热这里只有精品一区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜久久久在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产精品久久久久久av不卡| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久精品区二区三区| 亚洲av男天堂| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 午夜老司机福利剧场| 天天操日日干夜夜撸| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美女主播在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久国产精品麻豆| 国产精品熟女久久久久浪| 大香蕉久久成人网| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品免费大片| 日本黄色日本黄色录像| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 老司机影院成人| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 青春草视频在线免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 99久久精品一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品一二三区在线看| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久人人爽人人片av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 女性被躁到高潮视频| 最近中文字幕2019免费版| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美最新免费一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产成人freesex在线| 观看美女的网站| 亚洲精品美女久久av网站| 制服人妻中文乱码| 国产精品国产av在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品人妻在线不人妻| 伦理电影免费视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 一区在线观看完整版| 人妻系列 视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 水蜜桃什么品种好| av网站免费在线观看视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本-黄色视频高清免费观看| 99九九在线精品视频| 大陆偷拍与自拍| 99九九在线精品视频| 日本免费在线观看一区| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 卡戴珊不雅视频在线播放| 少妇高潮的动态图| 一级毛片我不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 色婷婷久久久亚洲欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品第二区| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美3d第一页| 精品国产一区二区久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产亚洲欧美精品永久| kizo精华| 国产男女内射视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 伦精品一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 九草在线视频观看| 亚洲国产最新在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美精品亚洲一区二区| 美女主播在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 少妇丰满av| 成年av动漫网址| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲天堂av无毛| 亚洲av不卡在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 丝瓜视频免费看黄片| 草草在线视频免费看| 国产乱人偷精品视频| 精品国产一区二区久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 嘟嘟电影网在线观看| 人人妻人人澡人人看| 久久精品国产a三级三级三级| 99久久中文字幕三级久久日本| 涩涩av久久男人的天堂| 99热网站在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产精品欧美亚洲77777| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费看光身美女| 日日爽夜夜爽网站| 女性生殖器流出的白浆| 春色校园在线视频观看| 全区人妻精品视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产成人精品在线电影| 超碰97精品在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 黑丝袜美女国产一区| 妹子高潮喷水视频| 国产男人的电影天堂91| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久国产一区二区| 亚洲成色77777| 成人二区视频|