AS1411輻射增敏機理的研究

李東梅 洪承皎 張保國

（蘇州大學醫(yī)學部放射醫(yī)學與防護學院 江蘇省放射醫(yī)學與防護重點實驗室 蘇州 215123）

核仁素是核仁中含量最豐富的磷酸化蛋白，它具有多種生物學功能：調(diào)控核糖體的合成與成熟，參與細胞增殖、生長、胞質分裂、染色質復制、核仁的發(fā)生等。核仁素在正常細胞中分布在細胞內(nèi)，但在腫瘤細胞和快速分裂細胞的細胞質中過度表達并轉移到細胞膜[1-2]。AS1411是核仁素的特異性核酸適配體，可以與腫瘤細胞表面的核仁素特異性結合[3-4]。AS1411是含26個堿基的G4序列核酸，目前已作為抗癌藥物進入二期臨床試驗研究，顯示出積極的抗腫瘤細胞增殖活性[5-6]。AS1411通過干擾各種增殖信號以破壞核仁素及其結合伴侶的相互作用來提高它的抗腫瘤細胞增殖作用，這些信號通路有NF-kB通路、PRMT5致癌基因通路和bcl-2抗凋亡途徑等[3-7]。本課題組通過克隆形成實驗已經(jīng)證明AS1411聯(lián)合X射線能夠降低照射后HeLa細胞的存活率，且HeLa細胞在AS1411濃度為500 nmol·L-1時的放射增敏比(SER)達到1.89[8]。本研究以人宮頸癌細胞HeLa為對象，從DNA損傷、細胞周期和細胞凋亡檢測方面進一步研究 AS1411的輻射增敏機理，為其應用于腫瘤放射治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

AS1411及其對照適配體 cApt（生工生物工程（上海）有限公司），AS1411序列為 5'-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTGg-3'，cApt序列為5'-TTC CTC CTC CTC CTT CTC CTC CTC CTC C-3'。DMEM 細胞培養(yǎng)基、小牛血清（美國Gibco公司）、胰酶（蘇州恩泰試劑有限公司）、碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染料（自美國Sigma公司）、抗γ-H2AX小鼠單克隆抗體（自美國Upstate公司）、二抗(羊抗鼠-FITC)（蘇州工業(yè)園區(qū)博美達試劑儀器有限公司）、BSA（Roche公司）、TritonX100（Amersharm公司）、DAPI染液和抗熒光淬滅封片劑（碧云天生物技術研究所）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司），激光共聚焦顯微鏡(TCS SP2，Leica公司)，流式細胞儀(Cytomics FC500, Beckman Coulter)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma3111)，酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司powerwave xs)，倒置顯微鏡(Olympus CK41)。

1.2 細胞培養(yǎng)

宮頸癌細胞株 HeLa為本實驗室保存，置于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，取指數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 AS1411和cApt儲存條件

AS1411和 cApt采用去離子水配制成濃度為1mmol·L-1的儲存液，于 4 ℃冰箱保存，使用時用DMEM培養(yǎng)基稀釋。

1.4 照射條件

應用美國RADSOURCE公司RS2000PRO型X射線生物照射儀照射細胞，射線能量160 kV，照射劑量率1.15 Gy·min-1。照射時使用直徑60mm的一次性塑料培養(yǎng)皿(Gibco)，皿內(nèi)培養(yǎng)液總體積2mL，將培養(yǎng)皿平放于照射區(qū)域中央，距X源中心40 cm。

1.5 γ-H2AX免疫熒光法檢測DNA損傷

取指數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液，培養(yǎng)皿中預先放置蓋玻片，種植于培養(yǎng)皿中爬片，設置正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組，培養(yǎng)8 h至細胞貼壁。在單純藥物組、照射+藥物組中加入 AS1411(或 cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和1 μmol·L-1。24 h后，X射線照射單純照射組、照射+藥物組細胞，吸收劑量分別為0 Gy、4 Gy和8 Gy，照后2 h做相應處理：加入抗γ-H2AX小鼠單克隆抗體(1: 500) 4 ℃冰箱中過夜，再于羊抗鼠-FITC二抗(1: 400)室溫孵育1 h，加入DAPI染液染核5 min，最后滴加6 μL抗熒光淬滅封片劑，將蓋玻片倒置在載玻片上，避光，在激光共聚焦顯微鏡下觀測每個細胞核內(nèi) DNA雙鏈斷裂所產(chǎn)生的熒光斑點數(shù)量。每個視野至少觀測100個細胞，記錄3個視野。

1.6 細胞周期檢測

取指數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液，培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h至細胞貼壁。換用無血清DMEM培養(yǎng)基，同步化12 h分組：正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組。單純藥物組、照射+藥物組加AS1411(cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和1μmol·L-1。24 h后，單純照射組、照射+藥物組 X射線照射細胞，照射劑量8 Gy，照射后于24 h時間點收集細胞；制備單細胞懸液，計數(shù)細胞調(diào)整細胞濃度為(5-10)×105mL-1，離心(1000 r·min-1, 5 min)，棄上清，用PBS洗2遍，加入70%冰乙醇1mL，吹打均勻，固定過夜，第2天加50 μɡ·mL-1PI染色液，置4 ℃避光染1 h后流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 細胞凋亡檢測

取指數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液，取 105個細胞種植于培養(yǎng)皿中，分設正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組，培養(yǎng)8 h至細胞貼壁。單純藥物組、照射+藥物組中加入AS1411(cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和 1μmol·L-1。24 h 后，單純照射組、照射+藥物組用X射線照射細胞，吸收劑量分別為0 Gy、4 Gy和8 Gy，照射后24 h用胰酶消化細胞，收集細胞，制備單細胞懸液，計數(shù)細胞并調(diào)整細胞濃度為(2-5) ×105mL-1，離心(1000 r·min-1, 5 min)，懸浮細胞，Annexin V-FITC 和Propidium Iodide染色，避光染30 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗時設 3個平行樣，實驗重復 3次。應用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結果用(±s)表示，重復測量采用方差分析，組間比較采用t檢驗。p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AS1411對HeLa細胞DNA損傷的影響

圖 1和圖 2分別為使用共聚焦顯微鏡觀察AS1411和cApt聯(lián)合X射線照射對HeLa細胞DNA雙鏈斷裂情況，藍色(DAPI)為細胞核，紅色(γ-H2AX)為雙鏈斷裂點。圖3a、圖3b分別是依據(jù)圖1、圖2統(tǒng)計的平均每個細胞核中DNA斷裂點數(shù)的柱狀圖。從圖3a可以看出，吸收劑量為0 Gy時，AS1411加藥組與正常對照組無差別；吸收劑量為4Gy時，對照組、500 nmol·L-1/AS1411 組和 1 μmol·L-1/AS1411組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)分別為(9.681±2.13)個、(16.137±2.03)個和(21.024±2.25)個；吸收劑量為8 Gy時，對照組、500 nmol·L-1/AS1411組和 1 μmol·L-1/AS1411組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)分別為(20.789±2.73)、(45.685±3.04)和 (61.052±2.68)個；即AS1411能夠增加輻射對HeLa細胞DNA的雙鏈斷裂。從圖3b可以得到，吸收劑量為0 Gy時，cApt加藥組與正常對照組無差別；吸收劑量為4 Gy時，對照組、500 nmol·L-1/cApt 組和 1μmol·L-1/cApt組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)分別為(9.681±2.13)、(11.011±1.63)和(10.026±1.22)個；吸收劑量為 8 Gy時，對照組、500 nmol·L-1/cApt組和 1 μmol·L-1/cApt組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)分別為(20.789±1.73)、(19.057±1.86)和(21.052±2.16)個；即在同一照射劑量下，各組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)相比較無差別。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察AS1411聯(lián)合X-射線照射對HeLa細胞DNA雙鏈斷裂的影響Fig.1 Confocal microscopy images of AS1411 combined with X-ray irradiation on HeLa cells DNA double-strand breaks

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察cApt聯(lián)合X-射線照射對HeLa細胞DNA雙鏈斷裂的影響Fig.2 Confocal microscopy images of cApt combined with X-ray irradiation on HeLa cells DNA double-strand breaks

圖3 不同濃度AS1411(a)、cApt (b)聯(lián)合X射線照射下平均每個細胞核中DNA斷裂點的數(shù)目Fig.3 The average number of DNA breakage points in each cell nucleus treated by AS1411 (a) and cApt (b) of different concentrations combined with X-ray irradiation

2.2 AS1411對HeLa細胞周期的影響

表1和表2分別為流式細胞儀檢測AS1411和cApt對HeLa細胞周期分布實驗結果。表1可看出，在不接受X射線照射條件下，不同濃度AS1411處理后G0/G1期、S期、G2/M期與正常對照組相比無明顯差別；8 Gy X-射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，但AS1411預處理并沒減少G2/M期阻滯，這表明AS1411增加HeLa細胞輻射增敏的機理與細胞周期無關。表2可看到，不接受X射線照射條件下，不同濃度cApt處理后與正常對照組相比較，各期細胞周期分布沒有發(fā)生變化；8 Gy X射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，cApt處理組與單純照射組相比無變化，可得出cApt對HeLa細胞周期分布沒有影響。

表1 AS1411不同處理組對HeLa細胞周期分布的影響Table 1 The effect of different treatment groups of AS1411 on Hela cell cycle distribution (%,±s)

表1 AS1411不同處理組對HeLa細胞周期分布的影響Table 1 The effect of different treatment groups of AS1411 on Hela cell cycle distribution (%,±s)

注: *與單純對照組相比，p<0.05。Note: *Compared with the control group, p<0.05.

組別/Grouping 樣本量/Sample number G0/G1 S G2/M Control 3 48.86±0.25 36.53±1.70 14.61±1.95 500 nmol·L-1 3 53.45±0.97 35.66±1.49 10.89±1.74 1 μmol·L-1 3 54.25±0.82 34.69±1.02 11.06±0.87 Irradiation 3 3.15±0.32 6.57±0.34 90.28±0.02 *Irradiation+500 nmol·L-1 3 3.82±0.48 9.09±0.30 87.09±0.58 *Irradiation+1 μmol·L-1 3 3.96±0.99 9.27±1.59 86.77±2.45 *

表2 cApt不同處理組對HeLa細胞周期分布的影響Table 2 The effect of different treatment groups of cApt on Hela cell cycle distribution (%, ±s)

表2 cApt不同處理組對HeLa細胞周期分布的影響Table 2 The effect of different treatment groups of cApt on Hela cell cycle distribution (%, ±s)

注: *與單純對照組相比，p<0.05。Note: *Compared with the control group, p<0.05.

組別/Grouping 樣本量/Sample number G0/G1 S G2/M Control 3 48.86±0.25 36.53±1.70 14.61±1.95 500nmol·L-1 3 48.06±3.48 35.75±0.53 16.19±2.93 1μmol·L-1 3 45.80±0.74 36.66±0.30 17.54±0.58 Irradiation 3 10.19±1.46 11.45±1.17 78.36±2.52 *Irradiation+500nmol·L-1 3 7.64±1.25 11.37±0.91 80.99±1.74 *Irradiation+1μmol·L-1 3 9.81±1.28 11.75±2.66 78.44±3.67 *

2.3 AS1411對輻射誘導HeLa細胞凋亡的影響

表 3、表 4分別為流式細胞儀檢測的 AS1411和cApt聯(lián)合不同劑量X射線照射對HeLa細胞凋亡率的實驗結果。由表3可見，在吸收劑量為0 Gy時，隨著AS1411濃度的增加，HeLa細胞的凋亡率也逐漸增高，即單獨用藥可增加細胞凋亡率；在相同照射劑量下，AS1411聯(lián)合X射線照射組較單純照射組的細胞凋亡率增加，且與濃度成正比關系，這表明AS1411可增加由輻射所導致的細胞凋亡。由表4可見，cApt對HeLa細胞凋亡率沒有影響。

表3 不同濃度AS1411對HeLa細胞凋亡率的影響Table 3 The effect of different concentration of AS1411 on Hela cell apoptosis (%,±s)

表3 不同濃度AS1411對HeLa細胞凋亡率的影響Table 3 The effect of different concentration of AS1411 on Hela cell apoptosis (%,±s)

吸收劑量 / Gy Absorbed dose凋亡率/Apoptosis rate 0 nmol·L-1 500 nmol·L-1 1 μmol·L-1 0 5.86±0.8 7.71±1.51 8.91±1.04 4 15.44±1.41 19.67±1.90 21.31±1.74 8 35.90±1.92 39.02±1.91 41.99±0.65

表4 不同濃度cApt對HeLa細胞凋亡率的影響Table 4 The effect of different concentration of cApt on Hela cell apoptosis (%, ±s)

表4 不同濃度cApt對HeLa細胞凋亡率的影響Table 4 The effect of different concentration of cApt on Hela cell apoptosis (%, ±s)

吸收劑量 / Gy Absorbed dose凋亡率/Apoptosis rate 0 nmol·L-1 500 nmol·L-1 1 μmol·L-1 0 4.91±1.27 4.99±0.28 5.26±0.41 4 15.37±1.22 14.31±0.27 15.39±2.58 8 34.80±0.40 33.67±1.05 34.05±1.65

3 討論

輻射增敏劑(Radiosensitizing agents)的研究是腫瘤放射治療的一個重要研究方向。輻射增敏劑是能夠增強生物體放射敏感性的一類物質，通過選擇性地殺傷乏氧腫瘤細胞、抑制放射損傷修復、調(diào)節(jié)細胞周期等來增強腫瘤細胞的放射敏感性，提高腫瘤治愈率，對于臨床治療具有重要意義。

核酸適配體AS1411具有多種優(yōu)越性能：親和力強、特異性高、制備廉價、高效快速、高穩(wěn)定性、尺寸小、易于修飾、免疫原性小和滲透性好等。核仁素是AS1411與細胞作用的靶點，AS1411能夠通過抑制核仁素的多種功能發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4,9-10]，如引起抗-凋亡bcl-2蛋白表達量降低而促進細胞凋亡，抑制NF-κB的活性，阻止DNA的復制等。Bates等[6]已經(jīng)研究了AS1411對80種人類細胞系的抗增殖活性，發(fā)現(xiàn)其幾乎對所有的腫瘤細胞增殖都有很好地抑制作用，而對正常細胞的毒性作用小。AS1411具有上述優(yōu)點，使其可以作為輻射增敏劑比較理想的候選者，本項研究希望進一步證明用AS1411抑制核仁素的功能，來提高腫瘤細胞的輻射敏感性。

雙鏈斷裂(DSBs)是電離輻射作用后 DNA最嚴重的損傷形式，DSBs修復缺陷導致輻射敏感性的顯著提高。DNA雙鏈斷裂后，斷裂點附近的組蛋白H2AX的C末端絲氨酸殘基會快速發(fā)生磷酸化，形成γ-H2AX。γ-H2AX數(shù)目可以用來檢測DSBs的數(shù)量[11]。由于γ-H2AX與DSB在數(shù)量上是l:l的關系，檢測γ-H2AX已成為探測DSB數(shù)量的金標準[12]。本實驗應用激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度 AS1411聯(lián)合X射線對HeLa細胞DNA損傷的影響，結果顯示：劑量為0 Gy時，AS1411加藥組與正常對照組相比較無差別；劑量為 4 Gy、8 Gy時，500 nmol·L-1/AS1411 組和 1 μmol·L-1/AS1411 組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點數(shù)明顯多于單純照射組；這表明AS1411能夠增加輻射對細胞DNA的雙鏈斷裂，即AS1411對HeLa細胞的輻射增敏機理與其增加DNA損傷作用有關。

細胞的輻射敏感性與多種因素有關，比如DNA雙鏈斷裂修復、細胞周期、細胞凋亡、蛋白激酶C、表皮生長因子受體、細胞內(nèi)谷胱甘肽的含量等[13]。在放射治療中，腫瘤細胞受到中、高劑量電離輻射照射后引起 DNA損傷，都會發(fā)生細胞周期阻滯現(xiàn)象，細胞周期的阻滯與細胞凋亡、分化密切相關，細胞通過G1/S期檢查點和G2/M檢查點保證細胞的復制[14]。當DNA損傷程度超過細胞的修復能力時，凋亡相關基因將被激活，則促使細胞凋亡。本實驗中用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化，從細胞周期實驗結果可以看出：在不接受X射線照射的條件下，不同濃度AS1411處理后G0/G1期、S期、G2/M期與單純對照組相比無明顯差別；8 Gy X射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，但AS1411預處理并沒有減少G2/M期阻滯，這表明AS1411增加HeLa細胞輻射敏感性的機理與細胞周期無關。從細胞凋亡實驗結果得出，AS1411提高HeLa細胞的凋亡率與藥物濃度正相關，表明 AS1411能夠促進輻射誘導的HeLa細胞凋亡，這與之前的研究結果一致[4]。本課題組通過克隆形成實驗已經(jīng)證明 AS1411聯(lián)合X射線可以降低照射后HeLa細胞的存活率，能夠提高HeLa細胞的放射敏感性[8]，本研究更進一步證明AS1411通過增加輻射對HeLa細胞DNA的雙鏈斷裂、促進輻射誘導的 HeLa細胞凋亡率的增加來提高其對 HeLa細胞的輻射增敏作用，將為宮頸癌的放射治療提供進一步的理論依據(jù)和基礎實驗依據(jù)。但是其確切的增敏機制尚不確定，還有待于進一步的深入研究。

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