谷子RNA干擾相關(guān)酶類基因家族的鑒定與分析

張司雯，鄧 欣，王 龍，羅皓天，王禹茜，王 月，李清竹，王紅艷

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院/ 植物表觀遺傳與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110036）

RNA 干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象普遍存在于動(dòng)物和植物中，是一種在進(jìn)化上高度保守的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。其是在3種核心酶類的作用下，利用雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘導(dǎo)形成的小RNA(small RNA, sRNA)，對(duì)目標(biāo)序列的mRNA進(jìn)行降解從而特異性地阻斷或抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程[1-2]。與RNA 干擾相關(guān)的酶類主要包含三大類：Dicer 酶、Argonautes(AGO)蛋白家族、RNA 依賴的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RDRs)，分別參與RNA 干擾過(guò)程中的啟動(dòng)階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段[3-4]。其中，RNA 干擾的啟動(dòng)階段需要通過(guò)多種途徑產(chǎn)生dsRNA，例如DNA的雙向轉(zhuǎn)錄途徑、自身互補(bǔ)的RNA 折疊途徑或異常合成的mRNA 的RNA 依賴性轉(zhuǎn)錄途徑等[5]。然后，互補(bǔ)的dsRNA 被具有RNaseⅢ型活性Dicers蛋白加工成長(zhǎng)度為21～26個(gè)核苷酸的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)或微小RNA (microRNA,miRNA)。其中一條RNA 通過(guò)AGO蛋白與沉默效應(yīng)復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，使這些復(fù)合物序列具有特異性的導(dǎo)向功能，從而找到與sRNA 互補(bǔ)的靶RNA，進(jìn)而通過(guò)阻斷翻譯或裂解靶mRNA 而導(dǎo)致靶基因的沉默或阻遏。這些sRNA 還可以通過(guò)將組蛋白和/或DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶募集到靶基因的調(diào)控序列中介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因沉默[5-6]。

目前已知的所有動(dòng)植物中均存在Dicer、AGO和RDR 基因的多個(gè)拷貝，并且部分基因的功能已被闡明[4]。以禾本科為例，水稻(Oryza sativa)中含有8個(gè)DCL類基因，分別是OsDCL1a、OsDCL1b、OsDCL1c、OsDCL2a、OsDCL2b、OsDCL3a、OsDCL3b、OsDCL4[4,7]。其中，OsDCL1在水稻miRNA 的加工過(guò)程中起到了十分重要的作用[8]。OsDCL3a和OsDCL3b的dsRB(double-stranded RNA‐binding)結(jié)構(gòu)域差異很大，因此有學(xué)者建議將其歸類為完全不同的第五類Dicer 蛋白[7]。OsDCL4負(fù)責(zé)正常植物發(fā)育所需的21個(gè)核苷酸的反式作用干擾小RNA(trans-acting siRNA, ta-siRNA)的加工[8-9]，且與水稻穗部的sRNA 生成有關(guān)[10]。

AGO蛋白家族是RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中的重要組成部分，該沉默復(fù)合物基于序列互補(bǔ)性使目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本沉默。水稻中鑒定出了19 種AGO基因[4]，在RNAi 和相關(guān)途徑中起著至關(guān)重要的作用，并調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[11]。如水稻中的AGO2已經(jīng)有研究表明在冷脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程中特異上調(diào)表達(dá)[12]。AGO1和AGO18具有協(xié)同抗病毒的能力[13]。OsAGO7控制水稻葉片向上卷曲[14]。此外，OsMEL1是一種獨(dú)特的AGO蛋白，可能通過(guò)由H3K9甲基化介導(dǎo)的染色質(zhì)修飾來(lái)調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂以及雌雄配子的正常發(fā)育。OsMEL1是否直接與調(diào)節(jié)性sRNA 相互作用以在染色質(zhì)上產(chǎn)生所需的改變尚不清楚[4]。水稻SHL2、SHL4/SHO2和SHO1分別編碼擬南芥(Arabidopsis thaliana)RNA 依賴性RNA 聚合酶6、AGO7和DICER-like 4的直系同源物，其突變通過(guò)ta-siRNA 影響葉片發(fā)育以及莖尖分生組織(shoot apical meristem,SAM)的完全缺失或異常形成[15]。OsPNH1作為AGO蛋白家族中的一員，與SAM和葉片的發(fā)育有關(guān)[16]。

RNA 依賴性RNA 聚合酶(RDRs)由RDR 基因編碼，在發(fā)育調(diào)控、維持基因組完整性和防御外源核酸等方面發(fā)揮著重要作用[17]。高等植物已經(jīng)進(jìn)化出多個(gè)依賴于RNA 的RDRs，其與Dicers(DCL)蛋白共同作用，產(chǎn)生具有特殊分子功能的不同種類的sRNA[10]。水稻中已經(jīng)報(bào)道5個(gè)RDRs相關(guān)基因[4]。擬南芥中RDR1、RDR2或RDR6功能的喪失可以增強(qiáng)植物對(duì)RNA 和DNA 病毒的敏感性[18]，水稻中OsRDR6介導(dǎo)的RNAi 途徑也與植物對(duì)病毒的防御反應(yīng)以及植物對(duì)細(xì)菌和真菌病原體的防御有關(guān)[19]。

谷子(Setaria italica)是適合于干旱地區(qū)種植的重要糧食作物和飼料作物。因其基因組較小(約515 Mb)，是二倍體C4類禾本科植物，自花授粉，易栽培，生育周期及繁殖期短，且與水稻基因組具有良好的共線性，因此經(jīng)常被視作分子遺傳學(xué)研究的模式作物[20-21]。近年來(lái)，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的谷子品種的基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，如xiaomi、Zhanggu、Yugu1、TT8等[22-24]，并開(kāi)發(fā)出了多種谷子功能組學(xué)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，如SIFGD和MDSi等[22,25]，但是對(duì)于谷子表觀遺傳學(xué)的研究仍然較少。因此，本研究以谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)對(duì)兩個(gè)代表性的谷子品種(xiaomi和Yugu1)進(jìn)行全基因組篩查與比較基因組學(xué)的研究，獲得谷子DCL 酶、AGO蛋白家族和RDR 類基因家族所有成員的序列信息，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并對(duì)其進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析和不同組織器官的特異性表達(dá)分析，為更深入地開(kāi)展谷子表觀遺傳學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選取谷子測(cè)序品種xiaomi和Yugu1(豫谷1)為研究對(duì)象，其基因組信息可在MDSi(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)和Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中得到。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的探尋

水稻基因組中RNA 干擾相關(guān)酶類基因的氨基酸序列通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道[4]和RGAP(http://rice.plantbio logy.msu.edu/)網(wǎng)站搜索得到，將這些基因序列本身或序列名稱在NCBI上校正，再與Phytozome[26]和MDSi[22]網(wǎng)站谷子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取相似度最高且E值最低的序列作為谷子中RNA 干擾相關(guān)酶類基因的候選序列。

1.2.2蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)分析

谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)[氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、分子式、脂肪指數(shù)、親水性的平均值(Grand average of hydropathicity,GRAVY)等]的分析使用Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)在線工具完成。

1.2.3亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及分析

利用BUSCA 亞細(xì)胞定位網(wǎng)站(http://busca.bioc omp.unibo.it/)對(duì)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

運(yùn) 用MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟 件 鄰 接 法(neighbor-joining method, NJ)對(duì)谷子和水稻的DCL 類、AGO類、RDR 類蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，boot strap設(shè)置為1000，Model/Method 設(shè)置為p-distance，其余采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行，得到的進(jìn)化樹(shù)輸出結(jié)果在EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)中進(jìn)行美化。

1.2.5保守結(jié)構(gòu)域分析

使用HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)對(duì)谷子和水稻RNA 干擾酶類基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，使用AI CS6 (Adobe illustrator CS6)進(jìn)行繪圖。

1.2.6谷子RNA 干擾酶類基因的蛋白質(zhì)保守基序鑒定及分析

利用MEME 在線網(wǎng)站(http://meme-suite.org/)對(duì)谷子RNA 干擾酶類基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行保守基序(Motif)分析。

1.2.7組織特異性表達(dá)分析

用于探索xiaomi 谷子中RNA 干擾相關(guān)酶類基因的不同組織的表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)在MDSi中獲得。Yugu1谷子中RNA 干擾相關(guān)酶類基因的不同組織的表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在SIFGD上獲得(原始序列號(hào)為SRR442161、SRR442162、SRR442163、SRR442164)[24-25]。 所 得 的FPKM(Fragments per Kilobase of exon model per million mapped fragments)值在TBtools[27]中的Heatmap中進(jìn)行可視化，Log Scale 中的Base設(shè)置為2.0，LogWith設(shè)置為1.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族的探尋及基本特征分析

通過(guò)同源性探索，共獲得24個(gè)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族序列(表1)，其中DCL 類7個(gè)(包括SiDCL1a、SiDCL1b、SiDCL1c、SiDCL2、SiDCL3a、SiDCL3b、SiSHO1)，AGO類13個(gè)(包 括SiAGO1b、SiAGO1c、SiAGO1d、SiAGO2、SiAGO4a、SiAGO4b、SiAGO12、SiMEL1、SiAGO14、SiAGO16、SiSHL4、SiAGO18、SiPNH1)，RDR 類4個(gè)(包 括SiRDR1、SiRDR2、SiRDR3、SiSHL2)。水稻中3個(gè)AGO基因(OsAGO3、OsAGO15、OsAGO17)在谷子中未找到同源序列，在這里不做研究。

通過(guò)對(duì)24個(gè)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類蛋白序列的分析發(fā)現(xiàn)(表1)，谷子與水稻的這些同源序列在長(zhǎng)度上相近，并且相似性較高，在xiaomi 基因組中，同源序列相似性略高，從53% (SiRDR3/OsRDR3)～91%(SiPNH1/OsPNH1)，在Yugu1基因組中，同源序列相似性從50% (SiAGO18/OsAGO18)～91% (SiPNH1/OsPNH1)，并且谷子品種間同源基因的整體相似性差異不大，說(shuō)明谷子間以及谷子與水稻間的這些基因在進(jìn)化上相對(duì)保守，行使的功能較為重要。此外，水稻中的多個(gè)蛋白序列，如OsDCL2a和OsDCL2b、OsAGO1a和OsAGO1b、OsAGO13和OsMEL1、OsAGO11和OsAGO12、OsRDR3和OsRDR4與谷子比對(duì)后，只能對(duì)應(yīng)到谷子的同一個(gè)序列。

表1 谷子與水稻中RNA 干擾相關(guān)酶類基因比較分析Table 1 Comparativeanalysisof RNA interference-related enzyme genesin Setaria italica and Oryza sativa

通過(guò)對(duì)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類蛋白序列的理化性質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)(表2)，氨基酸數(shù)從313(SiDCL1b)～1 933 (SiDCL1a)，分 子 量在35 044.76(SiDCL1b)～216 227.3 Da(SiDCL1a)，理論等電點(diǎn)在5.01(SiDCL1b)～9.55 (SiAGO12)，說(shuō)明這其中既有酸性蛋白質(zhì)又有堿性蛋白質(zhì)，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp +Glu)在43 (SiDCL1c)～257 (SiDCL1a)，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)在36(SiDCL1b)～241(SiDCL1a)，原子總數(shù)在4 913(SiDCL1b)～30 290(SiDCL1a)，脂肪指 數(shù) 在73.1 (SiAGO1b)～94.66 (SiDCL3b)，GRAVY在?0.536(SiAGO1b)～?0.172(SiDCL2)，除SiAGO1b是親水性蛋白質(zhì)外，其余均為兩性蛋白質(zhì)。

表2 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 2 Protein physical and chemical properties analysis of Setaria italica RNA interference-related enzyme genes

續(xù)表 2Table 2 (Continued)

通過(guò)對(duì)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)(表2)，除SiRDR2位于葉綠體類囊體膜、SiRDR3位于葉綠體外，其余均位于細(xì)胞核，這說(shuō)明這些酶類基因會(huì)在不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮不同的功能。

2.2 谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為探究谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)篩選出的谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，RNA 干擾相關(guān)酶類基因共分為3個(gè)進(jìn)化支。第一個(gè)進(jìn)化支包括所有的Dicer 家族和SHO1：Si/OsDCL1a、Si/OsDCL1b、Si/OsDCL1c、SiDCL2、Si/OsDCL3a、Si/OsDCL3b、Si/OsSHO1、OsDCL2a、OsDCL2b。第二個(gè)進(jìn)化支包括所有的RDR 家族和SHL2：Si/OsRDR1、Si/OsRDR2、Si/OsRDR3、OsRDR4、Si/OsSHL2。第三個(gè)進(jìn)化支包括所有的AGO蛋白家族以及MEL1、SHL4、PNH1：Si/OsAGO1b、OsAGO1a、Si/OsAGO1c、Si/OsAGO1d、Si/OsAGO2、OsAGO3、Si/OsAGO4a、Si/OsAGO4b、Si/OsAGO12、OsAGO11、OsAGO13、Si/OsAGO14、OsAGO15、Si/OsMEL1、Si/OsAGO16、Si/OsSHL4、Si/OsPNH1、OsAGO17、Si/OsAGO18。

圖1 谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree for the RNA interference-related enzyme genes in Setaria italica and Oryza sativa

2.3 谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類基因的保守結(jié)構(gòu)域分析

DCL酶類是RNAⅢ家族成員，通過(guò)對(duì)谷子和水稻DCL酶的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，Si/OsDCL1a、SiDCL2、OsDCL2a、OsDCL2b、SiDCL3a、Si/OsDCL3b、OsSHO1中含有與RNAⅢ家族相同的結(jié)構(gòu)域，即DEAD、Helicase_C、Dicer_dimer、PAZ和Ribonuclease_3結(jié)構(gòu)域。此外，SiSHO1和OsDCL3a 還有一個(gè)特有的ResⅢ結(jié)構(gòu)域，是Res亞基中的Ⅲ型限制酶，參與DNA 合成和ATP合成，具有水解酶活性。Dsrm 結(jié)構(gòu)域僅存在于SiDCL1a、Si/OsDCL1b、Si/OsDCL1c、OsDCL2b、Si/OsSHO1中；Si/OsDCL1b、Si/OsDCL1c與其他DCL酶相比只含有Dsrm 和Ribonuclease_3結(jié)構(gòu)域。

谷子和水稻的AGO蛋白家族除OsAGO13和OsAGO17外至少具有ArgoN、ArgoL1、PAZ和Piwi 4 個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖2)，除SiSHL4和OsAGO3之外，還均具有ArgoL2結(jié)構(gòu)域。在Si/OsAGO1、OsAGO4b、OsAGO11、Si/OsAGO12、OsAGO13、Si/OsAGO14、OsAGO18、Si/OsMEL1和Si/OsPNH1中還均具有共同的Argomid 結(jié)構(gòu)域，而Gly-rich_Ago1結(jié)構(gòu)域只存在于OsAGO1a、Si/OsAGO1b和SiAGO1d 中。SiMEL1在進(jìn)化樹(shù)和結(jié)構(gòu)域的結(jié)果中均與其他AGO基因聚為一類并與其他AGO酶類基因具有相同的結(jié)構(gòu)域。

在RDR 家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的探索中(圖2)，發(fā)現(xiàn)谷子和水稻的RDR 酶類均包含RdRP結(jié)構(gòu)域。

圖2 谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類的氨基酸結(jié)構(gòu)域分析Figure 2 Analysis of the amino acid domains of enzymesrelated to RNA interference in Setaria italica and Oryza sativa

2.4 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因蛋白質(zhì)保守基序分析

谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域主要包含5個(gè)保守基序：Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5，并且在大多數(shù)的谷子RNA 干擾酶類基因中均存在，說(shuō)明其基序是高度保守的(圖3)?；?的序列為RJIFYRDGVSEGQFT；基序2的序列為CHPTEFDFYLC；基序3 的序列為SRPAHYHVL YDENGF；基序4的序列為VPPAYYAHLAA；基序5的序列為GQWNMMNKKMVNGGKIRKWAC。從圖中分析得出，谷子RNA 干擾酶類基因的蛋白序列均含有這5個(gè)保守基序，說(shuō)明這5個(gè)基序在谷子RNA 干擾酶類基因蛋白的進(jìn)化中是高度保守的。

圖3 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因蛋白質(zhì)保守基序分析Figure 3 Analysis of protein conservative motifs in Setaria italica RNA interference-related enzyme genes

2.5 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因組織特異性表達(dá)分析

為了探索RNA 干擾相關(guān)酶類基因?qū)茸由L(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究對(duì)xiaomi 的6個(gè)發(fā)育時(shí)期(包括3周齡葉片、孕穗期的倒二葉、抽穗2 d 的穗、授粉時(shí)期的穗、灌漿期的穗和莖)以及Yugu1的穗、葉、莖、根4種組織器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖4)兩者轉(zhuǎn)錄組顯示的結(jié)果有一定的一致性也有各自的特點(diǎn)。xiaomi 中1個(gè)基因(SiDCL3b)在所有組織中均未檢測(cè)到表達(dá)，同時(shí)該基因在Yugu1中也僅在穗中檢測(cè)到低量表達(dá)，在Yugu1中未檢測(cè)到表達(dá)的SiRDR3在xiaomi 中檢測(cè)到的表達(dá)量也較低。在xiaomi和Yugu1中分別有5 個(gè)基因(SiDCL3a、SiAGO16、SiSHL4、SiRDR3、SiSHL2)和11個(gè) 基 因(SiDCL1a、SiDCL1b、SiDCL3b、SiSHO1、SiAGO12、SiAGO14、SiAGO16、SiSHL4、SiRDR2、SiRDR3、SiSHL2)在所有組織中檢測(cè)到較低表達(dá)[FPKM <7，即log2(FPKM +1)<3]。在xiaomi 和Yugu1中 分 別 有7 個(gè) 基 因(SiAGO1b、SiAGO1c、SiAGO1d、SiAGO2、SiAGO4a、SiAGO18、SiPNH1)和6個(gè) 基 因(SiAGO1b、SiAGO1c、SiAGO4a、SiPNH1、SiAGO18、SiRDR1)至少在一種組織中出現(xiàn)高表達(dá)[FPKM>20，即log2(FPKM+1)>4.39]，且xiaomi中SiAGO18僅在灌漿期的穗中特異性高表達(dá)，在Yugu1中SiAGO18相對(duì)其他時(shí)期在穗中表達(dá)量最高，SiAGO1b在4種組織中的表達(dá)量均最高，暗示了這些基因在組織發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)控作用。同時(shí)，在所分析的xiaomi 的6個(gè)組織中，所有基因在生長(zhǎng)3周的葉片中的表達(dá)量最低，在所有時(shí)期的穗以及灌漿期的莖中表達(dá)量較高，且分別有11、4、5、2個(gè)基因在抽穗2 d 的穗、授粉時(shí)期的穗、灌漿期的穗和灌漿期的莖中的表達(dá)達(dá)到了最高值。在所分析的Yugu1中AGO蛋白家族基因在4種組織中均有較高水平的表達(dá)，說(shuō)明在RNA 干擾過(guò)程中，AGO酶類基因處于核心位置[4]，谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因在穗和莖中相比其他組織中的表達(dá)量更高，這與其在穗和莖的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用有關(guān)[15]。

圖4 谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因組織特異性表達(dá)分析Figure 4 Transcriptome analysisof RNA interference-related enzyme genesin different Setaria italica tissues

3 討論與結(jié)論

由DCL、AGO和RDRs三類家族成員介導(dǎo)的RNAi 是一個(gè)重要的生理調(diào)控過(guò)程，在植物營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程，特別是在SAM 的發(fā)育以及從SAM 到花分生組織的轉(zhuǎn)變過(guò)程中具有重要作用[4]。但是，谷子中的這些基因尚未見(jiàn)報(bào)道。xiaomi作為一種超早熟材料，因其具有生長(zhǎng)周期短、基因組數(shù)據(jù)精準(zhǔn)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)全面，并已成功建立出高效穩(wěn)定的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系等特點(diǎn)，對(duì)谷子的功能基因組研究和功能基因利用起到重要的指導(dǎo)作用[22]，而Yugu1是第一個(gè)谷子基因組測(cè)序的品種，在谷子分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究中具有重要的參考價(jià)值。因此，本研究選取這兩個(gè)代表性的谷子品種，對(duì)其RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定。本研究共挖掘出24個(gè)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因，包括DCL 類7個(gè)，AGO類13個(gè)，RDR 類4個(gè)。分析并注釋了這些基因的長(zhǎng)度、相似度及氨基酸序列號(hào)，水稻中的多個(gè)蛋白序列與谷子比對(duì)后，只能對(duì)應(yīng)到谷子的同一個(gè)序列。說(shuō)明谷子在進(jìn)化過(guò)程中既與水稻保持了共線性又有其自身進(jìn)化的特點(diǎn)[21,28]。并通過(guò)對(duì)24個(gè)蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)分析以及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，以確定不同基因間的相互關(guān)系。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析了各個(gè)基因家族之間的進(jìn)化關(guān)系，Dicer 酶可催化dsRNA 產(chǎn)生小RNA，是重要的RNA 酶Ⅲ家族成員之一[29]。在植物中，RDR 參與了RNA 介導(dǎo)的DNA 甲基化途徑(RNA-directed DNA methylation,RdDM)，RdDM途徑不僅在突變、印記、基因調(diào)控和植物發(fā)育中起到重要作用，同時(shí)也影響轉(zhuǎn)座子沉默、基因組的穩(wěn)定性以及植物的脅迫反應(yīng)[30]。AGO蛋白作為效應(yīng)復(fù)合物的核心，在RNA 干擾中發(fā)揮重要作用[29]。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果揭示了谷子各基因家族成員的進(jìn)化過(guò)程及這些基因的多樣性。值得注意的是，谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因在Yugu1基因組中只是注釋成Dicer、AGO、RDR 基因，并沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行細(xì)化，而本研究結(jié)果則是對(duì)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富和補(bǔ)充。同時(shí)，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果可以看出，水稻和谷子的直系同源(orthologous)基因(如OsDCL3a 和SiDCL3a)在進(jìn)化樹(shù)上先聚為一支，再與旁系同源(paralogous)基因(OsDCL3b和SiDCL3b)聚為一大支，驗(yàn)證了谷子和水稻在進(jìn)化上的關(guān)系和地位。

在對(duì)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族的保守基序分析中發(fā)現(xiàn)這24個(gè)基因均含有5個(gè)共同的保守基序，說(shuō)明這些基序在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

在對(duì)谷子和水稻RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族的保守結(jié)構(gòu)域分析中發(fā)現(xiàn)，所有的DCL 酶、AGO蛋白家族、RDR 類家族各自具有共同的保守結(jié)構(gòu)域。具有相同結(jié)構(gòu)域的基因在功能上相似，行使相同的功能。DCL酶類家族中除氨基酸長(zhǎng)度較短的Si/OsDCL1b、Si/OsDCL1c外，均 具 有Helicase_C、Dicer_dimer、PAZ和Ribonuclease_3 4種結(jié)構(gòu)域；AGO酶類基因所包含的4種結(jié)構(gòu)域中，PAZ和Piwi結(jié)構(gòu)域是核心AGO蛋白家族最主要的功能域，PAZ 有助于siRNA 3′末端的結(jié)合，而Piwi 則將siRNA 的5′末端與靶RNA 結(jié)合[4]。水稻MEL1主要位于生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞的發(fā)育和減數(shù)分裂的進(jìn)程中具有特定的功能[31]。RDR 酶類家族中主要包含RdRP結(jié)構(gòu)域。因此，在對(duì)SiSHL2和SiSHL4進(jìn)行歸類時(shí)，由于SiSHL2與SiRDR1、SiRDR2具有相同的結(jié)構(gòu)域，其被定義為RDR 酶類相關(guān)基因，而SiSHL4是AGO酶類基因，可以看出，雖然它們?cè)诿舷嘟瑓s分別屬于不同的基因家族，在分類時(shí)需要特別注意。谷子與水稻同源基因間保守結(jié)構(gòu)域有細(xì)微差別，說(shuō)明谷子和水稻在進(jìn)化的過(guò)程中即有相同點(diǎn)又分別保持了自身的特點(diǎn)[28]。

雖然在組織特異性表達(dá)分析時(shí)選用xiaomi 對(duì)其他谷子品種來(lái)說(shuō)具有局限性，但是也具有一定的啟示作用。在水稻中已報(bào)道RNA 干擾途徑在生長(zhǎng)發(fā)育、花期轉(zhuǎn)變中的調(diào)節(jié)作用[32-34]，本研究也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)。高表達(dá)[FPKM> 20，即log2(FPKM+1)>4.39]的RNA 干擾相關(guān)酶類基因在亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中均定位在了細(xì)胞核中，而已有報(bào)道顯示細(xì)胞核中存在的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑有助于解釋植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制[35]。谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因在不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，xiaomi中3種酶類基因家族在谷子3周齡葉片中表達(dá)水平較低，在孕穗期的倒二葉中表達(dá)量次之，而在所有發(fā)育時(shí)期的穗和灌漿期的莖中表達(dá)量較高，分別有45.8%、16.7%、20.8%和8.3%的基因在抽穗2 d 的穗、授粉時(shí)期的穗、灌漿期的穗和灌漿期的莖中的表達(dá)達(dá)到了最高值，說(shuō)明在谷子的穗和莖中生成小RNA 途徑更活躍，暗示其在谷子SAM 的發(fā)育以及從SAM到花分生組織的轉(zhuǎn)變過(guò)程中的重要作用，有待于后續(xù)深入研究。在Yugu1中不同組織器官的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，3種酶類基因家族在谷子葉片和根中的表達(dá)水平相對(duì)較低，而在穗和莖中的表達(dá)量較高，說(shuō)明在谷子的穗和莖中生成小RNA 途徑更活躍。除此之外，SiDCL1c、SiDCL2、SiRDR1和SiAGO1b在各組織器官中的表達(dá)量均為同家族成員中的最高值，說(shuō)明這些基因在RNA 干擾過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。

本研究對(duì)谷子的RNA 干擾相關(guān)酶類基因家族進(jìn)行了挖掘和鑒定，共挖掘出24個(gè)谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因，其中DCL 類7個(gè)，AGO類13個(gè)，RDR 類4個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行了蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白質(zhì)保守基序分析、保守結(jié)構(gòu)域分析表明谷子RNA 干擾相關(guān)酶類基因在谷子營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)谷子兩個(gè)品種的不同組織器官中的表達(dá)分析表明RNA 干擾酶類基因中AGO酶類基因的作用較為關(guān)鍵，在穗和莖的生長(zhǎng)發(fā)育中RNA 干擾酶類基因發(fā)揮著關(guān)鍵作用，研究結(jié)果將對(duì)谷子功能基因組研究提供新的參考，對(duì)開(kāi)展谷子分子表觀遺傳學(xué)研究提供重要理論基礎(chǔ)。