尾巨桉愈傷組織蛋白質(zhì)含量和氧化酶活性比較

劉敏燕+沙月娥+歐陽樂軍+張潤桃+梁卓玲+甘四明

摘要:以尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E. grandis)無性系DH32-29無菌苗的莖段為外植體,優(yōu)化的激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)率高,隨后培養(yǎng)中愈傷組織分化出綠色?黃綠色?白色和褐色4種類型,綠色和部分黃綠色的為胚性愈傷組織,后兩種為非胚性愈傷組織?分別測定不同類型愈傷組織的蛋白質(zhì)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)?過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性,結(jié)果表明,愈傷組織蛋白質(zhì)含量從高到低為綠色?黃綠色?白色?褐色;胚性愈傷組織的SOD?POD和CAT活性顯著高于非胚性愈傷組織,并且綠色愈傷組織3種酶活性均高于其他愈傷組織?

關(guān)鍵詞:尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E. grandis);愈傷組織;過氧化物酶(POD);過氧化氫酶(CAT);超氧化物歧化酶(SOD)

中圖分類號(hào):S792.39;Q946.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)11-2581-03

Comparisons of Protein Contents and Oxidase Activity in Callus of

Eucalyptus urophylla×E. grandis Clone

LIU Min-Yan1,SHA Yue-E1,OUYANG Le-Jun1,ZHANG Run-Tao1,LIANG Zhuo-Lin1,GAN Si-Ming2,3

(1.College of Life Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong, China; 2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091,China; 3. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520)

Abstract: The MS medium was optimized with several hormone combinations for inducing hypocotyls of Eucalyptus urophylla × E. grandis clone DH32-29 to form callus. And the callus rate was high. The callus was differentiated into four types in subsequent culture including green, yellowish, white and brown calluses, in which the green and partial yellowish calluses were embryonic whereas the latter two were non-embryonic. Each callus type was sampled for measuring of protein content and enzymatic activity of superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD) and catalase(CAT). Results showed that the green callus had the highest protein content, followed by the yellowish, white and brown ones. In general, the embryonic callus had a higher SOD, POD and CAT activity than the non-embryonic had. The green callus had the highest activity of the three enzymes.

Key words: Eucalyptus urophylla × E. grandis; callus; superoxide dismutase(SOD); peroxidase(POD); catalase(CAT)

基金項(xiàng)目:國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102705);廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(1057912038);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013040014690);湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011C3104010);湛江師范學(xué)院人才引進(jìn)專項(xiàng)(ZL1302)

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)杯果木屬(Angophora)?傘房屬(Corymbia)和桉屬(Eucalyptus)植物的統(tǒng)稱,它具有速生?豐產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),已成為全球性的重要造林樹種,是優(yōu)良的紙漿?人造板和家具等工業(yè)用材,經(jīng)濟(jì)效益顯著[1]?尾葉桉(E. urophylla)與巨桉(E. grandis)的雜交種具有明顯的雜種優(yōu)勢,其良種在適應(yīng)性和經(jīng)濟(jì)性狀上均表現(xiàn)優(yōu)良?尾巨桉無性系已在廣東?廣西?海南和福建等地大面積推廣,造林面積已占全國桉樹人工林的40%以上,成為栽培面積最大的一類桉樹無性系[2]?目前,其種苗繁育一直是通過組織培養(yǎng),而體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑尚未開展研究?并且,尾巨桉胚性細(xì)胞繁殖快?同步性好,具有很強(qiáng)的接受外源DNA的能力,是進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的理想材料,有利于建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系;此外,胚性細(xì)胞誘導(dǎo)也廣泛用于離體種子資源的保存[3]?

胚性愈傷組織的高頻發(fā)生體系是胚性細(xì)胞誘導(dǎo)的前提,需要區(qū)分其與木質(zhì)化程度高?活力不強(qiáng)?難以接受外源基因的非胚性愈傷組織的生理生化差別?近年來,在植物胚性細(xì)胞發(fā)育及胚狀體發(fā)生過程的研究上,研究者已越來越多地探討體細(xì)胞胚性的啟動(dòng)及胚狀體發(fā)生的生理和分子機(jī)制?胚狀體發(fā)生是體細(xì)胞脫分化?進(jìn)而再分化的過程,與大量酶的特異合成和代謝相關(guān)?已有研究發(fā)現(xiàn),過氧化物酶(POD)和酯酶(EST)等在胚狀體發(fā)生中呈現(xiàn)一定的規(guī)律性[4],超氧化物歧化酶(SOD)?POD?過氧化氫酶(CAT)與胚性細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)[5]?

試驗(yàn)以尾巨桉無性系DH32-29無菌苗的莖段為外植體,MS為基本培養(yǎng)基,添加蔗糖?瓊脂?2,4-D和PBU誘導(dǎo)愈傷組織;隨后培養(yǎng)的愈傷組織分化出綠色?黃綠色?白色和褐色4種類型?繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用紫外分光光度計(jì)測定不同類型愈傷組織中蛋白質(zhì)的含量以及SOD?POD和CAT的酶活性,分析愈傷組織生理生化指標(biāo)與胚性愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)性?這將為提高DH32-29的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率奠定技術(shù)基礎(chǔ),也可為其他桉樹無性系的胚性愈傷組織誘導(dǎo)提供借鑒和參考?

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用材料為尾巨桉無性系DH32-29無菌苗的莖段?

試劑包括考馬斯亮藍(lán)G-250染料?95%乙醇?0.1 g/L結(jié)晶牛血清蛋白?愈創(chuàng)木酚?0.1 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液?30% H2O2?0.1 mol/L H2O2?0.05 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液(含 0.1 mmol/L EDTA)?0.13 mol/L甲硫氨酸等,試劑均為國產(chǎn)分析純,購自廣州化學(xué)試劑廠?

1.2方法

1.2.1胚性愈傷組織誘導(dǎo)將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+0.1 g/L VC,添加不同濃度的KT與2,4-D組合?PBU與IAA組合以及6-BA與2,4-D組合,pH 5.8~6.0),(25±2) ℃下暗培養(yǎng)14 d,接著光暗交替培養(yǎng)7 d,計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率和觀察胚性愈傷組織形成情況?

1.2.2蛋白質(zhì)含量及SOD?POD?CAT活性測定

1)酶液的制備?分別取綠色?黃綠色?白色和褐色愈傷組織0.4 g于預(yù)冷的研缽中,加入8 mL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液,磨成勻漿?將勻漿轉(zhuǎn)入10 mL離心管,1 000 r/min離心15 min,取上清液定容至10 mL,4 ℃保存?

2)蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?分別吸取1 g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0?0.01?0.02?0.03?0.04?0.05和0.06mL于10 mL具塞試管中,再分別加入0.15 mol/L NaCl 0.10?0.09?0.08?0.07?0.06?0.05和0.04 mL,各管再加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL,混勻,室溫放置10 min,于595 nm處測吸光度?以A595 nm為依變量(y)?蛋白質(zhì)濃度為自變量(x)進(jìn)行線性回歸,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?

3)蛋白質(zhì)含量測定?分別準(zhǔn)確吸取4種愈傷組織酶液0.1 mL于試管中,各管加入考馬斯亮藍(lán)5 mL,測其A595 nm,計(jì)算蛋白質(zhì)含量?

4)SOD活性測定?取10 mL試管5支,1支為暗對(duì)照,1支為光照對(duì)照,剩下3支為樣品重復(fù)測定?分別在560 nm下測定各管的吸光度,計(jì)算SOD活性?具體操作及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[6]?

5)POD活性測定?取10 mL試管5支,1支為暗對(duì)照,1支為光照對(duì)照,剩下3支為樣品重復(fù)測定?分別在470 nm下測定各管的吸光度,每隔1 min記錄1次A470 nm,共記錄5次,然后以每分鐘內(nèi)A470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)?具體操作及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[6]?

6)CAT活性測定?取10 mL試管3支,其中2支為樣品測定管,1支為空白管,加樣后在240 nm下比色,每隔1 min讀數(shù)1次,共測4 min,計(jì)算CAT活性?具體操作及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[6]?

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,得回歸方程:y=0.008 8x+0.012 9(r2=0.995 6)?由圖1可知,蛋白質(zhì)在0~60 μg/mL濃度范圍內(nèi)與A595 nm線性關(guān)系良好?

2.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種6~8 d后,DH32-29外植體兩端產(chǎn)生愈傷組織,整個(gè)外植體呈啞鈴狀,以后逐漸從兩端開始延伸形成膨大的愈傷組織?誘導(dǎo)形成的愈傷組織色澤?結(jié)構(gòu)各異,主要有綠色?黃綠色?白色和褐色4種類型(圖2)?其中,綠色愈傷組織活力最好,最先直接分化出綠色芽點(diǎn),形成不定芽;部分較淡的黃綠色愈傷組織在光照條件下也能慢慢轉(zhuǎn)綠?分化活力增強(qiáng),但也有部分在后續(xù)培養(yǎng)中變白?玻璃化;白色愈傷組織大多數(shù)不能進(jìn)一步分化形成不定芽;褐色愈傷組織活力最差,不能進(jìn)一步分化,漸漸干枯死亡?前兩種愈傷組織在后續(xù)繼代過程中,表面逐漸誘導(dǎo)出呈顆粒狀的胚性細(xì)胞團(tuán),形成胚性愈傷組織,大約占整個(gè)愈傷組織的80%左右;后兩種愈傷組織為非胚性愈傷組織?

2.3胚性與非胚性愈傷組織幾項(xiàng)生理指標(biāo)的差異

DH32-29胚性與非胚性愈傷組織的幾項(xiàng)生理指標(biāo)差異見表1?由表1可知,綠色愈傷組織中蛋白質(zhì)含量最高,其次為黃綠色愈傷組織,褐色愈傷組織的最低,即胚性愈傷組織相對(duì)非胚性愈傷組織蛋白質(zhì)含量要高,推測是因?yàn)榕咝杂鷤M織中的胚性細(xì)胞為胚狀體發(fā)生儲(chǔ)存營養(yǎng)?綠色愈傷組織的SOD?POD和CAT活性比其他顏色愈傷組織高,胚性與非胚性愈傷組織中SOD?POD和CAT活性存在顯著差異?

3小結(jié)與討論

胚性愈傷組織具有再生潛能,是良好的轉(zhuǎn)基因受體材料;非胚性愈傷組織難以轉(zhuǎn)化成功,也難以再生成植株?愈傷組織質(zhì)量決定遺傳轉(zhuǎn)化的成敗,也是影響高效再生的決定因素?本研究通過不同植物生長調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化組合誘導(dǎo)得到胚性愈傷組織,并實(shí)現(xiàn)胚性愈傷組織的再生?植物胚性愈傷組織形成過程中,相關(guān)酶類的活性變化十分明顯?比如POD是木質(zhì)素合成最后過程中的一種關(guān)鍵酶,隨著植株體內(nèi)的過氧化物酶含量下降,木質(zhì)素含量也隨之大幅度下降[7];尾葉桉中,黃真池等[8]發(fā)現(xiàn)具有高分化能力的淺綠色愈傷組織的POD?SOD和CAT等活性都要高于褐色和白色愈傷組織?SOD與機(jī)體衰老?營養(yǎng)狀況和輻射防護(hù)有關(guān),而CAT也是一種生物體內(nèi)的保護(hù)酶?Rajeswari等[9]報(bào)道, 香合歡(Albizia odoratissima)具分化能力愈傷組織的CAT活性明顯高于不具分化能力的愈傷組?

張獻(xiàn)龍等[10]指出,胚性愈傷組織中蛋白質(zhì)含量較高,推測在胚性愈傷組織形成過程中糖和淀粉轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)?本研究以不同類型的愈傷組織為材料,發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織中POD活性的差異較明顯,表明胚性愈傷組織的生理代謝能力較強(qiáng)?清除氧自由基的能力高?不易老化?活力旺盛;雖然胚性愈傷組織中蛋白質(zhì)含量?SOD和CAT活性均比非胚性愈傷組織中的高,但差異沒有POD的大?劉成圣等[11]在對(duì)苜蓿(Medicago sativa)體細(xì)胞發(fā)生和發(fā)育過程的研究也發(fā)現(xiàn),胚性愈傷組織SOD活性和POD活性比非胚性愈傷組織活性高,與本研究結(jié)果相似?Laukkanen等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)歐洲赤松(Pinus sylvestris)褐色組織中SOD活性比非褐色組織中的低?

深入研究尾巨桉無性系胚性愈傷組織的誘導(dǎo)條件以及胚性愈傷組織中POD?SOD和CAT等酶活性的變化規(guī)律,有助于尋找合適的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件?提高具分化能力的胚性愈傷組織的比例和提高不定芽的分化能力,也將為其他桉樹無性系的胚性愈傷組織誘導(dǎo)提供借鑒和參考?

參考文獻(xiàn):

[1] 楊民勝, 謝耀堅(jiān), 劉杰鋒. 中國桉樹研究三十年[M].北京:中國林業(yè)出版社, 2011.

[2] 歐陽樂軍,黃真池,沙月娥,等.新型分裂素PBU對(duì)尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響[J].植物生理學(xué)報(bào),2011,47(8):785-791.

[3] KONIECZNY R, BOHDANOWICZ J, CZAPLICKI A Z, et al. Extracellular matrix surface network during plant regeneration in wheat anther culture[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2005,83(2):201-208.

[4] COPPENS L, GILLIS E. Isoenzyme electrofocusing as a biochemical marker system of embryogenesis and organogenesis in callus tissues of Hordeum vulgare L.[J]. Journal of Plant Physiology,1987,127(1-2):153-158.

[5] 崔凱榮,任紅旭,刑更妹.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,34(3):93-99.

[6] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].第三版.北京:高等教育出版社,2003.

[7] GABALD?魷N C, L?魷PEZ-SERRANO M, PEDRE?譙O M A, et al. Cloning and molecular characterization of the basic peroxidase isoenzyme from Zinnia elegans, an enzyme involved in lignin biosynthesis[J]. Plant Physiology,2005,139(3):1138-1154.

[8] 黃真池, 歐陽樂軍, 曾富華, 等. 尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊, 2010,46(2):147-149.

[9] RAJESWARI V,PALIWAL K. Peroxidase and catalase changes during in vitro adventitious shoot organogenesis from hypocotyls of Albizia odoratissima L. f.(Benth)[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2008,30(6):825-832.

[10] 張獻(xiàn)龍, 孫濟(jì)中, 劉金蘭. 陸地棉品種“珂字201”胚性與非胚性愈傷組織生化代謝產(chǎn)物的比較研究[J].作物學(xué)報(bào),1992,18(3):175-182.

[11] 劉成圣, 徐達(dá), 孟祥紅, 等.苜蓿胚狀體的分離及其發(fā)育過程中幾種酶活性的變化[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2002, 48(2):249-252.

[12] LAUKKANEN H, RAUTIAINEN L, TAULAVUORI E, et al. Changes in cellular structures and enzymatic activities during browning of Scots pine callus derived from mature buds[J]. Tree Physiology,2000,20(7):467-475.

[5] 崔凱榮,任紅旭,刑更妹.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,34(3):93-99.

[6] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].第三版.北京:高等教育出版社,2003.

[7] GABALD?魷N C, L?魷PEZ-SERRANO M, PEDRE?譙O M A, et al. Cloning and molecular characterization of the basic peroxidase isoenzyme from Zinnia elegans, an enzyme involved in lignin biosynthesis[J]. Plant Physiology,2005,139(3):1138-1154.

[8] 黃真池, 歐陽樂軍, 曾富華, 等. 尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊, 2010,46(2):147-149.

[9] RAJESWARI V,PALIWAL K. Peroxidase and catalase changes during in vitro adventitious shoot organogenesis from hypocotyls of Albizia odoratissima L. f.(Benth)[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2008,30(6):825-832.

[10] 張獻(xiàn)龍, 孫濟(jì)中, 劉金蘭. 陸地棉品種“珂字201”胚性與非胚性愈傷組織生化代謝產(chǎn)物的比較研究[J].作物學(xué)報(bào),1992,18(3):175-182.

[11] 劉成圣, 徐達(dá), 孟祥紅, 等.苜蓿胚狀體的分離及其發(fā)育過程中幾種酶活性的變化[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2002, 48(2):249-252.

[12] LAUKKANEN H, RAUTIAINEN L, TAULAVUORI E, et al. Changes in cellular structures and enzymatic activities during browning of Scots pine callus derived from mature buds[J]. Tree Physiology,2000,20(7):467-475.

[5] 崔凱榮,任紅旭,刑更妹.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,34(3):93-99.

[6] 張志良,瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].第三版.北京:高等教育出版社,2003.

[7] GABALD?魷N C, L?魷PEZ-SERRANO M, PEDRE?譙O M A, et al. Cloning and molecular characterization of the basic peroxidase isoenzyme from Zinnia elegans, an enzyme involved in lignin biosynthesis[J]. Plant Physiology,2005,139(3):1138-1154.

[8] 黃真池, 歐陽樂軍, 曾富華, 等. 尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊, 2010,46(2):147-149.

[9] RAJESWARI V,PALIWAL K. Peroxidase and catalase changes during in vitro adventitious shoot organogenesis from hypocotyls of Albizia odoratissima L. f.(Benth)[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2008,30(6):825-832.

[10] 張獻(xiàn)龍, 孫濟(jì)中, 劉金蘭. 陸地棉品種“珂字201”胚性與非胚性愈傷組織生化代謝產(chǎn)物的比較研究[J].作物學(xué)報(bào),1992,18(3):175-182.

[11] 劉成圣, 徐達(dá), 孟祥紅, 等.苜蓿胚狀體的分離及其發(fā)育過程中幾種酶活性的變化[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2002, 48(2):249-252.

[12] LAUKKANEN H, RAUTIAINEN L, TAULAVUORI E, et al. Changes in cellular structures and enzymatic activities during browning of Scots pine callus derived from mature buds[J]. Tree Physiology,2000,20(7):467-475.