黃瓜胚狀體高頻再生體系的建立及優(yōu)化

劉 娜，薛婉鈺，陳盼盼，張婷婷，李 娟，陳書霞

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院/陜西省蔬菜工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

黃瓜是葫蘆科最主要的蔬菜作物之一[1]，在世界范圍內廣泛栽培。黃瓜營養(yǎng)豐富，清香可口，深受消費者喜愛，在蔬菜的周年供應上占有重要地位[2-3]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的統(tǒng)計資料顯示，我國黃瓜生產(chǎn)面積2019年底達125.83萬hm2，總產(chǎn)量約7 034萬t，以設施栽培為主要生產(chǎn)方式。隨著設施黃瓜栽培的快速發(fā)展和栽培面積的擴大，高溫適宜、濕度較高的環(huán)境條件使各種病害的發(fā)生越發(fā)嚴重[4-5]，尤其隨著設施種植年限的增長，病原菌抗藥性逐漸增加[6]，導致設施黃瓜病害有逐年加重的趨勢[5,7]。防治黃瓜病害、提高黃瓜產(chǎn)量及品質，已成為現(xiàn)階段黃瓜研究的首要問題[8]，培育抗病品種是解決該問題的有效途徑之一，但黃瓜的遺傳基礎狹窄[9]，常規(guī)育種年限長、效率低，因此對其進行遺傳轉化研究就顯得極為重要。

黃瓜離體再生培養(yǎng)可選用的外植體種類有子葉節(jié)、子葉、下胚軸、未授粉子房和成熟胚等[10-14]，一般可以通過器官再生和胚狀體再生兩種途徑進行[10,15]。器官再生途徑在進行進一步的遺傳轉化研究時，常存在轉化率低、嵌合體多、假陽性率高等問題[16-17]，限制了相關研究的進一步開展。胚狀體再生途徑因再生頻率高、體系穩(wěn)定及接受外源基因的能力強等特點而廣受關注，且該途徑獲得的植株遺傳穩(wěn)定性好[11,18-19]。在可選的外植體中，子葉節(jié)因易獲得且能產(chǎn)生胚狀體而成為眾多研究者首選的研究材料[10,20]，但受到基因型、激素等因素的影響胚狀體再生的頻率不同[10,12-13,21-24]。因此，有必要進一步對不同的基因型、激素濃度以及處理時長等因素進行研究，探索建立高頻穩(wěn)定的胚狀體再生途徑和方式。

本研究對黃瓜基因型、苗態(tài)、子葉切割方式、激素和無菌苗培養(yǎng)條件進行探索，研究這些因素對黃瓜胚狀體誘導率的影響，以期篩選適宜于體細胞胚發(fā)生的培養(yǎng)條件，為完善黃瓜胚狀體再生途徑、進一步建立黃瓜優(yōu)良的遺傳轉化受體系統(tǒng)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8份不同基因型黃瓜自交系材料Q24、Q16、9930、No.26、Gy14、No.14、S63和16F7-2-8，均由西北農(nóng)林科技大學園藝學院蔬菜生理與生物技術課題組保存，其中Q24、Q16、9930、No.26、S63及16F7-2-8屬于華北生態(tài)型，Gy14屬于加工腌漬型,No.14屬于和歐洲溫室型。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 挑選約150粒飽滿無損傷的黃瓜種子放入干凈的培養(yǎng)瓶中，使用氯氣消毒1～2 h后取出，用滅菌蒸餾水浸泡2～3 h，放入超凈工作臺，用體積分數(shù)為3%的NaClO消毒15 min，繼而用體積分數(shù)為75%的酒精消毒60～90 s，無菌水晃動清洗3～4次后置于無菌濾紙上，待其表面水分全部晾干后，接種到MS培養(yǎng)基上，標注品種及處理日期，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)無菌苗。培養(yǎng)條件為：溫度22 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d，空氣濕度80%～90%。

1.2.2 愈傷組織及胚狀體的誘導 無菌苗生長至種皮脫落、子葉未展開狀態(tài)時，從子葉遠軸端切除1/2，保留約1 mm的下胚軸，再將兩子葉縱向剖開，除去生長點，即得子葉節(jié)外植體。將子葉節(jié)外植體接種至含1.5 mg/L 2,4-D的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每瓶接種6個外植體，每個材料接種15瓶，培養(yǎng)20～25 d后，將產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離，分別接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶接種6塊，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1節(jié)，20～30 d后觀察愈傷組織的出胚情況。

1.3 黃瓜胚狀體誘導影響因素試驗

1.3.1 黃瓜基因型 將不同基因型的黃瓜種子按1.2.1節(jié)方法培養(yǎng)無菌苗，再按照1.2.2節(jié)方法誘導胚狀體的發(fā)生，最后觀察愈傷組織狀態(tài)及胚狀體產(chǎn)生情況。

1.3.2 無菌苗苗態(tài) 無菌苗的苗態(tài)按照子葉展開程度劃分為3級：子葉未展開，呈抱合狀態(tài)(圖1-A)；子葉即將展開，呈半抱合狀態(tài)(圖1-B)；子葉展開，2片子葉呈分離狀態(tài)(圖1-C)。本試驗以Gy14和9930為材料，子葉節(jié)切割方式為從子葉遠軸端切除1/2，保留約1 mm的下胚軸，再將兩子葉縱向剖開，除去生長點。將不同狀態(tài)的子葉節(jié)切割好后分別置于含1.5 mg/L 2,4-D的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20～25 d后，將產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離，分別放置于MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導胚狀體的發(fā)生，統(tǒng)計胚狀體誘導率及成苗率。所有培養(yǎng)階段的溫度均為22 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d，空氣濕度80%～90%。

A.子葉未展開，呈抱合狀態(tài)；B.子葉即將展開，呈半抱合狀態(tài)；C.子葉展開，兩子葉呈分離狀態(tài)A.Cotyledons clasped;B.Cotyledons about to unfold and semi-closed;C.Cotyledons unfolded and separated圖1 黃瓜無菌苗的3種苗態(tài)Fig.1 Three seedling states of cucumber sterile seedlings

1.3.3 子葉切割方式 子葉切割方式為從子葉遠軸端切除1/2，然后按保留下胚軸的長短分為3個處理：不保留下胚軸、保留約1 mm下胚軸和保留約2 mm下胚軸，具體切割方式如圖2所示。將切割好的子葉節(jié)置于含1.5 mg/L 2,4-D的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20～25 d后，將產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離，分別放置于MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導胚狀體的發(fā)生，統(tǒng)計胚狀體誘導率及成苗率。培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)。

A.切除1/2 子葉，不保留下胚軸；B.切除1/2 子葉，保留約1 mm下胚軸；C.切除1/2 子葉，保留約2 mm下胚軸A.Removing 1/2 cotyledon and leaving hypocotyl unreserved;B.Removing 1/2 cotyledon and hypocotyl reserved for 1 mm;C.Removing 1/2 cotyledon and hypocotyl reserved for about 2 mm圖2 黃瓜子葉的3種切割方式Fig.2 Three cutting ways of cucumber cotyledons

1.3.4 無菌苗培養(yǎng)階段光暗處理方式 在無菌苗培養(yǎng)階段設置光、暗2種培養(yǎng)方式，光培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d；暗培養(yǎng)不照光。2種處理的其他培養(yǎng)條件一致，溫度均為22 ℃，空氣濕度均為80%～90%。將培養(yǎng)好的不同苗齡(2，3 d)無菌苗按1.2.2節(jié)方法進行愈傷組織及胚狀體的誘導，統(tǒng)計胚狀體誘導率及成苗率。愈傷組織誘導及胚狀體誘導階段的培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)。

1.3.5 2,4-D質量濃度 在魏文霞等[10]試驗方法的基礎上，設置2,4-D的質量濃度梯度分別為0.75，1.00，1.50，2.00 mg/L。按照1.3.2節(jié)的方法切割子葉節(jié)形成子葉節(jié)外植體，將其分別接種至含上述不同質量濃度2,4-D的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20～25 d后，將產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離，分別放置于MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導胚狀體的發(fā)生，統(tǒng)計胚狀體誘導率及成苗率。培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)。

1.3.6 胚性愈傷的誘導時長 將1.2.2節(jié)得到的子葉節(jié)放置在附加有1.0 mg/L 2,4-D的誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷，設置誘導時間分別為20，30和60 d，將產(chǎn)生的愈傷組織與外植體分離，分別放置于MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導胚狀體的發(fā)生，統(tǒng)計胚狀體誘導率及成苗率。培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)。

1.4 9930和Gy14體細胞胚的觀察

將9930和Gy14產(chǎn)生的胚狀體置于體視熒光顯微鏡(徠卡MZ10F，德國)下，觀察胚狀體發(fā)生各個時期的形態(tài)并拍照。

1.5 植株再生與馴化移栽

用鑷子將9930和Gy14愈傷組織上肉眼可見的胚狀體小心挑下或輕輕撥下，接種至MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。待植株生長至肉眼可見其生長點時逐漸打開瓶口，進行馴化，最后移栽至基質中，統(tǒng)計成苗率。

1.6 數(shù)據(jù)調查與統(tǒng)計分析

胚狀體誘導率及成苗率的計算方法如下：胚狀體誘導率=產(chǎn)生胚狀體的愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)×100%，成苗率=所得正常植株個數(shù)/胚狀體個數(shù)×100%。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 基因型對黃瓜愈傷組織和胚狀體誘導的影響

如圖3所示，所有基因型黃瓜的子葉節(jié)在1.5 mg/L 2,4-D誘導下均可產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織的形態(tài)有所不同，有些種質材料的子葉節(jié)誘導的愈傷組織發(fā)綠、質感堅硬，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中愈傷組織表面逐漸變白，如No.26(圖3-D)、Q24(圖3-G)、16F7-2-8(圖3-C)等，這樣的愈傷組織轉移到胚狀體誘導培養(yǎng)基上后，形成的胚狀體很少(圖4-A)。而部分種質材料誘導的愈傷組織發(fā)白，質地松軟，用鑷子觸碰易散開，如9930(圖3-B)和Gy14(圖3-E)，這樣的愈傷組織轉移到胚狀體誘導培養(yǎng)基上后，容易誘導出較明顯的胚狀體(圖4-B，C)。

A.No.14；B.9930；C.16F7-2-8；D.No.26；E.Gy14；F.Q16；G.Q24；H.S63圖3 不同基因型黃瓜子葉節(jié)在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結果 Fig.3 Culture results of different genotypes of cucumber cotyledon nodes on callus induction medium

A.16F7-2-8；B.Gy14；C.Gy14愈傷組織的局部放大A.16F7-2-8；B.Gy14；C.Local magnification of Gy14 callus圖4 不同基因型黃瓜的愈傷組織在胚狀體誘導培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Fig.4 Growth of callus from different cucumber genotypes cultured on embryo induction medium

2.2 無菌苗苗態(tài)對黃瓜胚狀體誘導的影響

為了解無菌苗不同苗態(tài)對胚狀體誘導率的影響，以Gy14和9930為試驗材料，分別對其3種不同的苗態(tài)進行了胚狀體誘導試驗。由表1可知，Gy14子葉在未展開狀態(tài)下的胚狀體誘導率為39.3%，較子葉即將展開和子葉展開狀態(tài)下的胚狀體誘導率(6.7%和12.1%)高;成苗率為50.0%,也較子葉即將展開和子葉展開狀態(tài)下的成苗率(26.5%和28.6%)高。9930子葉未展開、子葉即將展開和子葉展開狀態(tài)下的胚狀體誘導率分別為38.7%，23.4%和20.8%，成苗率分別為4.2%,3.7%和9.1%,子葉未展開狀態(tài)下的胚狀體誘導率約是子葉即將展開狀態(tài)下的1.65倍，約是子葉展開狀態(tài)下的1.86倍。由此可見，Gy14和9930均以子葉未展開時較為幼嫩的狀態(tài)適宜胚狀體的誘導。由于Gy14的胚狀體誘導率和成苗率較9930高，因此后續(xù)試驗均以Gy14作為胚狀體再生體系優(yōu)化的研究對象。

表1 無菌苗苗態(tài)對黃瓜胚狀體誘導率和成苗率的影響Table 1 Effects of sterile seedling states on cucumber induction rate of embryoid and seedling formation rate

2.3 子葉切割方式對黃瓜胚狀體誘導的影響

由表2可知，子葉節(jié)下端不保留下胚軸的處理胚狀體誘導率為68.9%，成苗率為61.3%；子葉節(jié)下端保留約1 mm下胚軸的處理與不保留下胚軸的處理相比，胚狀體誘導率和成苗率相對較高，分別為85.2%和69.5%；子葉節(jié)下端保留約2 mm下胚軸的切割方式胚狀體誘導率和成苗率均最低，分別為40.0%和50.0%。

表2 子葉切割方式對黃瓜胚狀體誘導率和成苗率的影響Table 2 Effects of cutting ways of cotyledon on cucumber induction rate of embryoid and seedling formation rate

2.4 無菌苗培養(yǎng)階段光暗處理對黃瓜胚狀體誘導的影響

將消毒后的黃瓜種子置于不同光暗條件下促使其萌發(fā)，同時選取不同苗齡(2，3 d)的材料作對比，其胚狀體誘導結果如表3所示。由表3可知，無菌苗培養(yǎng)階段的光暗處理對于后期胚狀體誘導率的影響無明顯規(guī)律，苗齡2 d的外植體在光照條件下胚狀體誘導率和成苗率較黑暗條件下高，分別為58.7%和87.3%；而苗齡3 d的外植體在黑暗條件下的胚狀體誘導率和成苗率較高，分別為39.5%和31.0%。

表3 無菌苗培養(yǎng)階段光暗條件對黃瓜胚狀體誘導率和成苗率的影響Table 3 Effects of light and dark treatment of sterile seedlings on cucumber induction rate of embryoid and seedling formation rate

2.5 2,4-D質量濃度對黃瓜胚狀體誘導的影響

由表4可知，愈傷組織誘導過程中所用激素的質量濃度是影響胚狀體誘導和再生的關鍵因素。適宜于Gy14子葉節(jié)誘導胚狀體的2,4-D質量濃度為1.00 mg/L，此條件下的胚狀體誘導率為31.7%，約是2,4-D質量濃度為2.00 mg/L時胚狀體誘導率的3倍。降低或升高2,4-D的質量濃度都會使胚狀體誘導率有所下降，如2,4-D質量濃度為0.75 mg/L時，胚狀體誘導率為23.1%。適宜于Gy14子葉節(jié)誘導所得胚狀體再生為正常植株的2,4-D質量濃度為0.75 mg/L，此條件下的成苗率為66.7%，約是2,4-D質量濃度為1.00 mg/L時的2倍。

表4 2,4-D質量濃度對黃瓜胚狀體誘導率和成苗率的影響Table 4 Effects of 2,4-D concentration on cucumber induction rate of embryoid and seedling formation rate

2.6 愈傷組織誘導時長對黃瓜胚狀體誘導的影響

由表5可知，在愈傷組織誘導階段，不同誘導時長對后期胚狀體的誘導有一定影響。在含1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中誘導30 d的愈傷組織，胚狀體誘導率和成苗率相對較高，分別為39.6%和65.6%；誘導時長為20 d時，胚狀體誘導率為39.5%，與誘導時長為30 d時的差異不大；誘導60 d的愈傷組織胚狀體誘導能力出現(xiàn)了一定程度的下降，誘導率僅為18.3%。

表5 愈傷組織誘導時長對黃瓜胚狀體誘導率和成苗率的影響Table 5 Effects of induction time of callus on cucumber induction rate of embryoid and seedling formation rate

2.7 黃瓜胚狀體的觀察

如圖5所示，9930和Gy14的胚狀體發(fā)育都經(jīng)歷了球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚4個階段；將得到的完整胚狀體從愈傷上挑下，置于MS培養(yǎng)基上后，可逐漸發(fā)育成為完整的植株。

A.9930球形胚；B.9930心形胚；C.9930魚雷形胚；D，E.9930子葉形胚；F.9930小植株；G.Gy14球形胚；H.Gy14心形胚；I.Gy14魚雷形胚；J，K.Gy14子葉形胚；L.Gy14小植株A.Globular embryo of 9930;B.Heart-shape embryo of 9930;C.The torpedo shaped embryo of 9930;D,E.Cotyledinous stage embryo of 9930;F.Plantlets of 9930;G.Globular embryo of Gy14;H.Heart-shape embryo of Gy14;I.The torpedo shaped embryo of Gy14;J,K.Cotyledinous stage embryo of Gy14;L.Plantlets of Gy14圖5 不同發(fā)育時期的黃瓜胚狀體及其萌發(fā)而成的小植株Fig.5 Cucumber embryoids at different development stages and their germinated plantlets

3 討 論

3.1 植物胚狀體發(fā)生的影響因素

植物胚狀體的萌發(fā)是一個相對復雜的過程，受到多種因素的影響，如基因型、外植體狀態(tài)、培養(yǎng)條件、激素濃度等[10,20,23,25-26]，其中基因型是影響胚狀體發(fā)生的一項至關重要的因素，黃瓜的組織培養(yǎng)具有較強的基因型特異性。多項研究均表明，不同的基因型材料具有不同的胚狀體誘導率，且差異顯著[10,20,27]。唐莉等[28]認為，基因型影響胚狀體再生的可能原因有以下兩種：一是不同基因型材料的胚狀體再生頻率不同；二是不同基因型材料胚狀體再生的最適刺激條件不同，從而導致胚狀體再生頻率不同。因此，根據(jù)不同的基因型探索不同的誘導條件，對于快速高效實現(xiàn)體細胞胚的再生具有重要的實踐意義。本試驗探索了8種基因型材料的出胚能力，發(fā)現(xiàn)Gy14是這些材料中較為適宜用于胚狀體萌發(fā)的黃瓜種質。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，即使是同一種質，同一處理條件下的胚狀體誘導率也會有較大差異，推測其可能原因是不同批次的種子飽滿度、生活力等有所不同，萌發(fā)所得無菌苗的活力存在一定差異，進而影響了胚狀體再生。

目前，有關無菌苗苗齡對胚狀體再生影響的研究鮮有報道，但在器官再生途徑的研究中，多以1～4 d作為黃瓜最佳苗齡，也有選擇5～7 d的[15,29-30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，試驗過程中可能會由于黃瓜種子活力或浸種方式的不同，導致種子的萌發(fā)速率有較大差異，最終影響到無菌苗達到最佳再生狀態(tài)所需的時間[31]，因此以幼苗的生理學狀態(tài)即苗態(tài)(生理苗齡)作為判斷外植體狀態(tài)的主要依據(jù)可能更為準確。本試驗發(fā)現(xiàn)，Gy14和9930子葉未展開狀態(tài)下的外植體其胚狀體誘導率較子葉即將展開狀態(tài)下的胚狀體誘導率高，表明子葉處于較為幼嫩的狀態(tài)時有利于胚狀體的誘導。

愈傷組織誘導階段所用外源激素的種類及其質量濃度對胚狀體的誘導發(fā)生具有關鍵性作用，但不同研究者使用的激素種類和質量濃度卻不完全相同[32-34]。目前的研究多選用2,4-D作為誘導胚狀體再生的外源激素，如馮琴等[20]以黃瓜種質9101為試驗材料，發(fā)現(xiàn)在添加2.0 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷，有利于胚狀體的再生。魏文霞等[10]以黃瓜種質14-1為試驗材料，發(fā)現(xiàn)在愈傷組織誘導階段添加1.5 mg/L 2,4-D對胚狀體的誘導效果最好。也有研究者將2,4-D與其他激素進行組合，用于胚狀體的誘導，如張蕾琛等[35]研究表明，南瓜未授粉子房在MS+4.00 mg/L 2,4-D+1.00 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA的條件下培養(yǎng)，其胚狀體誘導率最高。本試驗基于前人研究結果，選用2,4-D作為誘導胚狀體再生的外源激素，并設置不同的質量濃度和處理時長，結果發(fā)現(xiàn)適宜于黃瓜種質Gy14胚狀體誘導的2,4-D質量濃度為1.00 mg/L，相應的最適處理時長為30 d；適宜于Gy14胚狀體誘導后再生為植株的2,4-D質量濃度為0.75 mg/L，此時的成苗率為66.7%，約是2,4-D質量濃度為1.00 mg/L時的2倍。因此，愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加多大質量濃度的2,4-D才能獲得最佳的胚狀體誘導率和成苗率，仍需進一步的研究。

3.2 植物胚狀體發(fā)生數(shù)量的統(tǒng)計方法

目前，在胚狀體數(shù)量統(tǒng)計及胚狀體誘導率計算時，不同的學者采用了不同的方法，常用的統(tǒng)計方式有2種，其一是統(tǒng)計產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)目，計算產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)目與總外植體數(shù)目的比值[10,20,36-37]。基二是統(tǒng)計產(chǎn)生的胚狀體數(shù)目，計算產(chǎn)生的胚狀體數(shù)目與總外植體數(shù)目的比值[38-39]，本試驗發(fā)現(xiàn)，胚狀體的發(fā)生是一個復雜而逐漸變化的過程，部分胚狀體呈細小簇狀，在觀察統(tǒng)計的時候，對于這些尚未成形的微小胚狀體可能無法用肉眼分辨其具體數(shù)目，因此選擇用第一種方式計算不同處理的胚狀體誘導率，但這種統(tǒng)計方式也不十分準確，無法甄別愈傷組織上單個或成簇出現(xiàn)的胚狀體。因此，如何更加準確地計算外植體的胚狀體誘導率，判斷胚狀體再生體系的高效性，仍需進一步研究。

4 結 論

適宜于黃瓜胚狀體再生的材料為Gy14。適宜于Gy14胚狀體再生的條件為：在子葉未展開、仍呈抱合狀態(tài)、較為幼嫩時作為外植體進行誘導，此時胚狀體誘導率最高，可達66.7%；子葉節(jié)切割時，保留約1 mm下胚軸處理的胚狀體誘導率最高，可達85.2%，其成苗率可達69.5%；無菌苗培養(yǎng)過程中進行16 h/d光照處理或全天暗處理，對于胚狀體誘導率的影響無明顯規(guī)律；適宜于Gy14胚狀體萌發(fā)的2,4-D質量濃度為1.00 mg/L，此時的胚狀體誘導率為31.7%；胚狀體誘導階段的適宜培養(yǎng)時間為30 d，此條件下誘導率為39.6%，與培養(yǎng)時間為20 d的誘導率十分相近，但成苗率大約是培養(yǎng)20 d時的2倍。這些條件的確定，為后期建立合適的黃瓜再生體系奠定了基礎。