正交設(shè)計(jì)優(yōu)選白術(shù)多糖提取工藝

★ 付祥平 龔千鋒

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtactylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，其性味苦、甘、溫，具有健脾燥濕、利水消腫、安胎等功效。近年對(duì)白術(shù)的研究多圍繞其揮發(fā)油及內(nèi)酯類成分展開，而對(duì)多糖的研究鮮見報(bào)道。本文擬通過正交試驗(yàn)來初步優(yōu)選白術(shù)多糖的提取工藝，以期為后續(xù)白術(shù)多糖研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 白術(shù)藥材(產(chǎn)地浙江，購(gòu)于樟樹藥材市場(chǎng))，葡萄糖對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究檢所，批號(hào)：110833-201205)，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 電子天平(TE212-L,北京賽多利斯)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS,上海亞榮生儀器廠)超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4,國(guó)華電器廠)循環(huán)水式真空泵(SHZ-D)紫外可見分光光度計(jì)(UV-2550,日本島津)。

1.3 方法

1.3.1 白術(shù)多糖提取工藝流程 白術(shù)→粉碎(過四號(hào)篩)→70%乙醇浸提(除低聚糖等雜質(zhì)) →抽濾后得濾渣→加水浸提→濾液水定容→測(cè)定多糖含量。

1.3.2 提取方法 精確稱取白術(shù)粉末約2g置于250mL圓底燒瓶中，加70%乙醇100mL加熱回流1.5h過濾，收集殘?jiān)⒓尤胍欢康恼麴s水在一定溫度下加熱回流一定時(shí)間，過濾，殘?jiān)?0mL蒸餾水洗滌兩次，濾液定容于250mL量瓶中。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品9.0mg置于25m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.4，0.6，1.0，2.0mL，分別置于10mL量瓶中，各加水使成2mL,然后加入1.0mL4%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸7.0mL搖勻后置于40℃水浴中加熱15 min取出置于冷水中冷卻10 min同時(shí)用蒸餾水做空白對(duì)照，紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度。

1.3.4 樣品吸光度的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法，精密吸取樣品溶液1mL置于25mL量瓶中，加水稀釋定容，得母液。精密吸取母液1mL置于10mL量瓶中，加水至2mL,再加入1mL4%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸7mL,搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出置冷水中冷卻10min。同時(shí)以蒸餾水做空白，用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。多糖提取率用下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.0034C-0.0087(r=0.9984)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取室溫下放置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品苯酚硫酸法顯色后，分別在0, 10, 30, 60, 120 min時(shí)測(cè)定吸光度，其RSD為0.58%，表明苯酚硫酸法顯色后120min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)測(cè)量6次，其吸光度RSD為0.43%。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，照“1.3.2”項(xiàng)下提取得樣品溶液，苯酚硫酸法顯色后，測(cè)定吸光度，計(jì)算其RSD為0.91%。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)多糖提取率的影響 白術(shù)中含有單糖，低聚糖，苷類，多糖等多種成分，其中多糖溶于水而不溶于高濃度乙醇，利用此原理先用70%的乙醇除去低聚糖等對(duì)多糖含量有影響的物質(zhì)。然后用水提法提取多糖，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素研究其對(duì)多糖提取率的影響。

2.3.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

固定溫度80℃，用100mL 70%乙醇回流1.5h后，改用水提取次數(shù)1次，在料液比1∶20下，分別在40, 50, 60, 70, 80, 90,100℃下加熱回流2h，測(cè)得結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可見，隨著溫度的升高，多糖提取率不斷升高，在90℃前一直處于升高趨勢(shì)，90℃達(dá)到最高，以后逐漸降低，溫度在80℃，90℃,100℃的提取率之間無顯著差異。從得到的多糖溶液還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，多糖色澤加深。并且溫度較低時(shí)的多糖溶液較溫度較高時(shí)的多糖溶液難過濾?？紤]到高溫可能對(duì)多糖結(jié)構(gòu)與活性有一定影響，超過100℃多糖可能會(huì)降解，故選擇80～100℃作為提取的適宜溫度。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 固定溫度80℃，用100mL 70%乙醇回流1.5h后，改用水提取1次，在料液比1∶20下，分別在80℃下加熱回流1,2,3,4,5小時(shí)，測(cè)得結(jié)果見圖2。

由圖2可見，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷升高，在3h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率基本平緩，說明白術(shù)多糖已基本提取完畢，從節(jié)省能源，減少生產(chǎn)周期考慮，提取時(shí)間以3h左右為宜。

2.3.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響 固定溫度80℃，用100mL 70%乙醇回流1.5h后，改用水提取次數(shù)1次，在80℃下，分別以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，測(cè)得結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

從圖3可看出開始隨著料液比的增加，多糖的提取率隨之增加，這是因?yàn)榧铀吭酱髣t提取出來的多糖越容易溶解，損失就越少，但到達(dá)1∶20時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后隨著料液比的繼續(xù)增加，提取率不再增加，稍呈下降趨勢(shì)。故以1∶20左右為宜。

2.3.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響 固定溫度80℃，用100mL 70%乙醇回流1.5h后，改用水提取，在提取溫度80℃、料液比1∶20下，分別加熱回流1，2，3，4，5次，每次1h，測(cè)得結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

從圖4可看出，隨著提取次數(shù)的增加，提取率增加逐漸減緩，提取4次與提取3次比較其提取率基本沒有增加。所以從生產(chǎn)周期，節(jié)省能源，降低生產(chǎn)成本考慮提取次數(shù)選2次為宜。

2.4 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化白術(shù)多糖提取工藝 選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)四因素，綜合單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做正交實(shí)驗(yàn)。因素及水平見表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2～3。

表1 因素水平表

表2 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 白術(shù)多糖提取工藝方差分析表

2.5 結(jié)論 由上方差分析，溫度為影響白術(shù)多糖提取主要因素取A2,根據(jù)實(shí)際B因素取B3，C因素取C1，D因素取D2，以節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間及成本。故最佳試驗(yàn)方案為A2B3C1D2，即固定溫度80℃，用100mL 70%乙醇回流1.5h后，在90℃下，以料液比1∶20，改用水加熱回流提取3h白術(shù)多糖提取率最高。