過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)*

★ 史鎖芳 周奎龍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇 南京 210029)

基于已發(fā)表文獻(xiàn)中的造模方法均為單純過(guò)敏性鼻炎模型或哮喘模型，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，選擇國(guó)內(nèi)常用的SD大鼠，在傳統(tǒng)模型制作方法基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良摸索出一種新的大鼠過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征模型建立方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠20只，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2008-0010)。將大鼠按體重采用隨機(jī)區(qū)組法分為2組，每組10只。分別為:(1)對(duì)照組(193.89±7.17)g；(2)模型組(193.25±14.44)g；具有可比性。

1.2 試劑與儀器 (1)試劑:卵白蛋白:由上海伯奧生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)(101008)。(2)主要儀器:萊卡切片機(jī)(德國(guó)Leica公司,型號(hào):RM2128)；熒光顯微鏡(日本制造，OLYMPUS型號(hào):BX51)；照相機(jī)(日本制造，型號(hào)：OLYMPUS C-35AD-2)；超聲霧化器(德國(guó)百瑞公司)；自制透明帶蓋塑料盒(50cm×30cm×20cm)等。

1.3 造模方法 運(yùn)用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻擊法造模:卵白蛋白腹腔注射14天后，用卵白蛋白連續(xù)鼻部滴注7天，建立模型[1-3]。初次致敏第7天開(kāi)始用卵白蛋白滴鼻，1次/天，10μL/次。連續(xù)滴鼻7天。之后隔日給予卵白蛋白1g/L滴鼻，以維持對(duì)鼻黏膜的刺激。每隔7天觀察一次鼻部滴蛋白液30分鐘內(nèi)搔鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)。采取記分法記錄鼻分泌物量、噴嚏次數(shù)及鼻癢程度。方法如下:(1)鼻涕:流至前鼻孔1分;超過(guò)前鼻孔2分;涕流滿面3分。(2)噴嚏:4個(gè)以內(nèi)1分;5～10個(gè)2分;10個(gè)以上3分。(3)鼻癢:輕度抓鼻1分;頻繁抓鼻2分;抓鼻不止3分。自鼻腔激發(fā)開(kāi)始觀察30分鐘，采用疊加法記分，總分超過(guò)5分為動(dòng)物造模成功。

從第15日開(kāi)始,將模型組大鼠置于密閉器皿內(nèi)(自制的50cm×30cm×20cm透明帶蓋塑料盒),給予2%OVA溶液進(jìn)行霧化吸入；對(duì)照組以生理鹽水代替。設(shè)定霧化流量為3 mL/min,每次持續(xù)霧化20min激發(fā)哮喘,觀察大鼠反應(yīng),以出現(xiàn)抖毛、毛發(fā)豎立、抓鼻、咳嗽、打噴嚏、腹式呼吸、呼吸急促甚則出現(xiàn)口唇、雙耳紫紺、伸頸、縮胸、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、抽搐、跌倒、大小便失禁等。待出現(xiàn)癥狀后,隨機(jī)從正常組和模型組各取2只作病理切片,模型組較正常組支氣管黏膜及黏膜下層組織有大量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管壁增厚、平滑肌增生、管腔狹窄、組織黏膜輕度充血水腫等典型的氣道炎癥及重建表現(xiàn),視為造模成功。

1.4 一般狀況觀測(cè) 觀察實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠的呼吸頻率、精神、飲食、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便等。

1.5 標(biāo)本采集與觀測(cè)

1.5.1 大鼠血樣采集 常規(guī)方法采血后用于血漿各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5.2 鼻部標(biāo)本采集 大鼠麻醉處死后，完整切取頭部：部分直接取鼻部標(biāo)本凍存；部分用中性甲醛固定，取鼻部標(biāo)本石蠟包埋，行HE染色。

1.5.3 肺部標(biāo)本采集 分離主支氣管，打開(kāi)胸腔，結(jié)扎左側(cè)支氣管，通過(guò)主支氣管下管約1cm進(jìn)行右肺肺泡灌洗，每次注入37%生理鹽水0.6mL，緩慢注入后再緩慢回抽共3次，收集1.35～1.55mL液體為合格，4℃，1 500rpm離心10min，上清于-20℃保存以備相關(guān)因子檢測(cè)。肺泡灌洗液的離心沉淀物待進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。左肺留取部分肺組織10%中性福爾馬林和石蠟包埋后進(jìn)行HE染色病理學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組大鼠反應(yīng)靈敏,未見(jiàn)異常。模型組經(jīng)抗原激發(fā)后張口喘息,腹部翕動(dòng),易激惹,躁動(dòng)不安,抖毛,抓鼻,打噴嚏,甚則出現(xiàn)口唇及雙耳紫紺,飲水量明顯增多,精神萎靡,食量減少,反應(yīng)遲鈍,活動(dòng)明顯減少或俯臥不動(dòng),毛色發(fā)黃卷曲,枯槁無(wú)華。造模后，造模各組大鼠鼻炎癥狀累計(jì)積分平均達(dá)到5分以上，與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 造模前后大鼠鼻炎癥狀積分比較

注：與對(duì)照組比較P<0.05。

2.2 肺泡灌洗液 大鼠模型組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞的百分比明顯增加，與對(duì)照組比較，﹡﹡P<0.01，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 造模前后大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及EOS水平

注：EOS采用瑞氏染色法，與對(duì)照組比較，﹡﹡P<0.01。

2.3 組織病理形態(tài)學(xué)的變化(HE染色)

對(duì)照組鼻黏膜及支氣管粘膜上皮完整,細(xì)、小支氣管結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組:支氣管粘膜上皮破壞明顯,上皮細(xì)胞有不同程度壞死且有脫落，粘膜下可見(jiàn)大量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)有少量分泌物及炎性細(xì)胞。

2.3.1 鼻黏膜組織(已切片,HE×40)

2.3.2 肺組織(已切片.HE×10)

3 討論

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是最常見(jiàn)的呼吸道疾病之一，哮喘的發(fā)病率居高不下，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有3億哮喘患者，目前已成為全球公共健康問(wèn)題[4]。哮喘往往是全身性過(guò)敏性疾病的下呼吸道的表現(xiàn)，哮喘患者多伴有過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis AR)。目前，AR已影響到10%～25%的世界人口[5]，我國(guó)兒童AR的患病率為21.9%～38.5%，2009年中國(guó)《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》顯示我國(guó)中心城市變應(yīng)性鼻炎的平均患病率為11.1%[6]，其中1/3的變應(yīng)性鼻炎患者會(huì)發(fā)展成哮喘。有研究認(rèn)為，患有AR的患者發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是未患有AR的患者的3～6倍，哮喘患者中AR的發(fā)生率為80%左右，大多數(shù)重癥哮喘患者不能達(dá)到良好控制的原因也包括AR的處理不規(guī)范。因此，AR是哮喘的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)于伴有過(guò)敏性鼻炎的哮喘的治療是我們面臨的一個(gè)臨床難題。

3.1 鼻-肺反射假說(shuō)[7]如果鼻部疾病引起的分泌物倒流則可刺激咽喉部，從而引起支氣管平滑肌收縮和下呼吸道炎癥；尤其是AR時(shí)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)直接流向鼻后刺激咳嗽感受器，造成炎癥持續(xù)狀態(tài)；持續(xù)釋放的炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致支氣管平滑肌的痙攣，使血管通透性增加，炎癥細(xì)胞激活并募集于氣道，從而使支氣管炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出級(jí)聯(lián)放大的效應(yīng)。

3.2 變應(yīng)性鼻炎和哮喘 AR與哮喘的發(fā)病都與特應(yīng)性有關(guān)，AR和哮喘無(wú)論在發(fā)病機(jī)制還是病理生理過(guò)程都是一致的[8]。變應(yīng)性鼻炎是接觸過(guò)敏原后，由IgE介導(dǎo)產(chǎn)生鼻黏膜炎癥，從而表現(xiàn)出鼻部癥狀的一種疾患。變應(yīng)性鼻炎和哮喘都是IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)，兩者的病理學(xué)改變都存在著嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[9]，變應(yīng)性鼻炎是發(fā)生哮喘的重要而獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。當(dāng)前“同一氣道，同一疾病”的觀點(diǎn)已經(jīng)被普遍接受，此觀點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了變應(yīng)性鼻炎和哮喘的密切關(guān)系，這一點(diǎn)在變應(yīng)性鼻炎與哮喘的研究中已經(jīng)充分證實(shí)，因而在哮喘的診斷和治療過(guò)程中，必須兼顧變應(yīng)性鼻炎的治療。2009年WHO在日內(nèi)瓦會(huì)議上形成并在Journal of Allergy and Clinical Immunology雜志發(fā)表的《重癥哮喘共識(shí)》[10]中強(qiáng)調(diào)了變應(yīng)性鼻炎是哮喘控制的重要影響因素。2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)《難治性哮喘診斷與處理專家共識(shí)》中同樣指出：變應(yīng)性鼻炎在難治性哮喘患者中非常常見(jiàn)[11]。在國(guó)外進(jìn)行的一項(xiàng)大規(guī)模變應(yīng)性鼻炎與哮喘治療的研究中發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合管理變應(yīng)性鼻炎與哮喘可顯著降低醫(yī)療費(fèi)用、改善患者癥狀并提高患者的生活質(zhì)量。

3.3 合格的動(dòng)物模型研制，是研究開(kāi)發(fā)過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征新方法新制劑的基礎(chǔ)和必要條件，檢索文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征動(dòng)物模型的建立方法，為此我們進(jìn)行了初步嘗試。研究表明，氣道慢性炎癥是哮喘的病理學(xué)基礎(chǔ)，支氣管高反應(yīng)性(BHR)和肺嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)炎癥是哮喘的主要特征。嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)于氣道炎癥和氣管高反應(yīng)性的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系極為密切[12]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠模型BALF中的細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞的結(jié)果及組織病理學(xué)的觀測(cè)與臨床相符，發(fā)病機(jī)理相似，可以初步認(rèn)為此模型制作方法是成功的，有一定的推廣價(jià)值。當(dāng)然，我們應(yīng)當(dāng)看到，物種之間的差異性也使得動(dòng)物模型的局限性不可避免，沒(méi)有一個(gè)模型能完全具有人類哮喘的特征，提示我們今后要合理利用動(dòng)物模型。

[1]趙宇，C.A ndrew vanHasse l t，吳港生,等.卵白蛋白經(jīng)鼻致敏建立變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型[J].中華耳鼻喉頭頸外科雜志,2005,40(3):176-180.

[2]Sugimoto Y，Ishizawa K，Saitou K，et al. Effect of mometasone furoate by topical application on allergic rhinitis model in rats[J].Pharmacology，2000,61:91-95.

[3]余建瑋,薛漢榮,程光宇,等.中醫(yī)寒哮動(dòng)物模型的建立[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(11):1 755-1 758.

[4]Christopher S. Stevenson, Mark A. Birrell. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance[J].Pharmacology & Therapeutics. 2011;130:93-105.

[5]Braman SS. The global burden of asthma[J].Chest.2006;130(1 Suppl.): 4S-12S.

[6]變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南[J].中華耳鼻喉頭頸外科雜志,2009,44:977-978.

[7]龐玲玲，殷凱生.支氣管哮喘和鼻-鼻竇疾病[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33:564-565.

[8]Zheng T，Yu J，Oh MH，et al. The atopic march: progression from atopic dermatitis to allergic rhinitis and asthma[J].Allergy Asthma Immunol Res, 2011,3(2):67-73.

[9]Casale M, Pappacena M, Potena M, et al. Nasal polyposis:from pathogenesis to treatment ,an update[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2011,10:158-163.

[10]Uniform definition of asthma severity,control,and exacerbation:Document presented for the world Health Organization Consultation on Severe Asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126:926-938.

[11]難治性哮喘診斷與處理專家共識(shí)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33:572-573.

[12]Corry DB, Irvin CG. Promise and pitfalls in animal-based research: building a better mousetrap[J].Immunol Res, 2006,35(3):279-294.