β－環(huán)糊精輔助提取沙棘總黃酮工藝研究

吳春芝，谷福根，師帥，孟根達(dá)來，王毅，張愛武

(1;內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古呼和浩特010050;2;內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010100)

β－環(huán)糊精輔助提取沙棘總黃酮工藝研究

吳春芝1，谷福根1，師帥2，孟根達(dá)來1，王毅1，張愛武1

(1;內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古呼和浩特010050;2;內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010100)

目的研究β-環(huán)糊精(β-CD)輔助提取沙棘總黃酮(TFH)的新工藝。方法以β-CD為輔助材料，提取沙棘中沙棘總黃酮，同時(shí)測定沙棘總黃酮的提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量等指標(biāo)，并與傳統(tǒng)醇提、水提工藝進(jìn)行比較。結(jié)果β-CD輔助提取新工藝的沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量等指標(biāo)，與醇提工藝接近，但明顯優(yōu)于水提工藝(P＜0;05)。結(jié)論β-CD輔助提取新工藝具有成本低、安全性高、無污染等特點(diǎn)，具有應(yīng)用前景。

沙棘;總黃酮;β-環(huán)糊精;包合作用;提取工藝;紫外分光光度法

沙棘為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L;的干燥成熟果實(shí)，蒙古族習(xí)用藥材［1］，具有活血散瘀、化痰寬胸、補(bǔ)脾健胃、生津止渴、清熱止瀉之功效［2］。沙棘中含有黃酮類、萜類、甾體類、揮發(fā)油類、糖類和有機(jī)酸等多種成分［3］。其中，沙棘總黃酮(TFH)具有抗心肌缺血、抗心律失常、調(diào)血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多種藥理作用［4］，還可直接清除超氧陰離子及羥基自由基，抗衰老作用顯著［5］。目前，沙棘中沙棘總黃酮的提取方法主要有水浸提法、堿水浸提法以及乙醇提取法等［6-8］。前兩種方法，均以水作為溶劑，雖然成本低，但提取率低，產(chǎn)物中水溶性雜質(zhì)多，故工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用很少;乙醇提取法是目前應(yīng)用最廣的沙棘總黃酮提取工藝，但這種方法需要大量乙醇，且成本高、周期長、安全性差。近年來，國內(nèi)有學(xué)者采用β-環(huán)糊精(β-CD)作為輔助性材料，提取丹參、虎杖和蒙藥廣棗總黃酮(TFC)中有效成分，取得較理想結(jié)果［9-11］。鑒于沙棘總黃酮與廣棗總黃酮結(jié)構(gòu)相似，筆者將系統(tǒng)研究β-CD對沙棘中沙棘總黃酮提取的實(shí)際影響，旨在得到一種經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)境污染少的沙棘提取新工藝。

1 儀器與試藥

UV-2401 PC型可見-紫外分光光度計(jì)(日本島津);T-1000型電子天平(美國雙杰兄弟公司);AB265-S型電子天平(瑞士梅特勒·托利多公司);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。沙棘購于內(nèi)蒙古林蒙醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為10080-200707);β-環(huán)糊精(山東新大精細(xì)化工有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 總黃酮含量測定[1，12]

溶液制備:精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加30%乙醇適量，超聲使溶解，放冷后再加30%乙醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的蘆丁對照品溶液。取沙棘粗粉2 g，加60%乙醇40 mL，加熱回流1 h，提取2次，紗布過濾，合并2次濾液，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

測定波長選擇:量取蘆丁對照品溶液2;0 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1;0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁試液1;0 mL，搖勻，放置6 min，再加10%氫氧化鈉試液10 mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，以相應(yīng)試劑作空白，于分光光度計(jì)在370～700 nm波長范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果測得最大吸收波長為500 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:精密量取對照品溶液1;0，2;0，3;0，4;0，5;0，6;0 mL，分別置25 mL量瓶中，按測定波長選擇項(xiàng)下同法操作，于500 nm波長處測定各吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，得回歸方程A=0;010 7C+0;026，r=0;999 8 (n=6)。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0;2～1;2 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

加樣回收試驗(yàn):精密量取已知質(zhì)量濃度的沙棘總黃酮供試品溶液9份，每份1;0 mL，置25 mL量瓶中，分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，同法處理后，以其中1份不加氫氧化鈉試液的樣品為空白，于500 nm波長處測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．2 藥材中沙棘總黃酮含量的測定

按照2010年版《中國藥典(一部)》沙棘項(xiàng)下規(guī)定，依法測定。取沙棘粗粉2 g，精密稱定，加60%乙醇30 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘?jiān)俜謩e加60%乙醇25 mL，加熱回流2次，每次1 h，濾過。合并濾液，置100 mL量瓶中，殘?jiān)?0%乙醇洗滌，洗液并入同一量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試液1;0 mL，置25 mL量瓶中，同法處理后，以1份不加氫氧化鈉試液的樣品為空白，于500 nm波長處測定吸光度，結(jié)果沙棘藥材中沙棘總黃酮的含量為(49;8±2;6)mg/g，n=3，符合藥典有關(guān)規(guī)定。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2．3 β－CD對沙棘總黃酮提取量的影響

取沙棘粗粉9份，每份5 g，分別加入β-CD 0，0;25，0;5，1;0，1;5，2;0，2;5，3;0，4;0 g，各加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，加熱回流1 h，紗布過濾，濾液定容于100 mL量瓶中。精密量取提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1;0 mL，置25 mL量瓶中，同法處理后，于500 nm波長處測定吸光度并計(jì)算沙棘總黃酮提取量，結(jié)果見圖1?？梢?，隨著β-CD加入量的增加，藥材中沙棘總黃酮的提取量逐漸增加，當(dāng)β-CD加入量為2;0 g時(shí)，沙棘總黃酮提取量達(dá)到最大值。

圖1 β-CD加入量對沙棘總黃酮提取量的影響

2．4 β－CD輔助提取工藝與傳統(tǒng)工藝的比較

β-CD輔助提取法:稱取沙棘粗粉5 g，加入β-CD 2;0 g，加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，加熱回流1 h，以紗布趁熱濾過，藥渣再加入β-CD 2;0 g，加蒸餾水100 mL，回流1h，濾過，合并兩次濾液，置250 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得提取液。

乙醇提取法［8］:稱取沙棘粗粉5 g，加60%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，紗布過濾，再重復(fù)提取1次，過濾，合并濾液，置250 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，得提取液。

水提取法:稱取沙棘粗粉5 g，加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，煮沸回流1 h，紗布過濾，藥渣再加蒸餾水100 mL，繼續(xù)提取1 h，過濾，合并濾液，定容于250 mL量瓶中。

分別精密量取上述3種提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1;0 mL置25 mL量瓶中，同法處理后，于500 nm波長處測定吸光度，計(jì)算各自的沙棘總黃酮提取量及提取率;另分別取提取液10 mL，置已干燥恒重的坩堝中，在水浴上蒸干后，于90℃干燥至恒重，冷卻，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏中沙棘總黃酮含量。結(jié)果見表2?？梢姡?種提取法中，采用醇提法所得沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量最高，其次為β-CD輔助提取法，水提取法最差。

表2 3種不同提取工藝試驗(yàn)結(jié)果比較(n=3)

3 討論

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用普通濾紙過濾沙棘提取液，濾紙容易堵塞而導(dǎo)致濾速緩慢，改用多層紗布過濾，效果較好。此外，因沙棘總黃酮水溶性較差，故提取液需趁熱過濾，否則，測定結(jié)果將偏低。需要注意的是，在采用β-CD輔助提取沙棘總黃酮過程中，當(dāng)加入β-CD的量超過2 g時(shí)，β-CD與沙棘總黃酮所形成的部分包合物在溫度較低時(shí)可能以沉淀形式析出，也可導(dǎo)致測定結(jié)果偏低，故在過濾以及顯色操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制溫度條件。

β-CD加速沙棘總黃酮提取進(jìn)程，提高提取率的主要機(jī)制為:在提取過程中，β-CD與沙棘總黃酮形成包合物［13］，從而增加了沙棘總黃酮的溶解度以及從藥材中溶出的速度;包合物的形成使提取液中沙棘總黃酮濃度降低，增大了藥材組織與提取液間的濃度梯度，從而加快了沙棘總黃酮的擴(kuò)散速度［14-15］。

盡管β-CD輔助提取法的沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量與傳統(tǒng)乙醇提取法比較，有顯著性差異(P＜0;05)，但仍明顯優(yōu)于水提取法。此外，該提取工藝生產(chǎn)成本低，安全性高，無環(huán)境污染，設(shè)備要求低，也適合于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的沙棘總黃酮提取新工藝。同時(shí)，需要指出的是，新工藝在提取物中引入了一定量的β-CD，因而如何去除它仍有待進(jìn)一步研究。

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Study on Extraction Process of Total Flavones from Hippophae Fructus with β-Cyclodextrin

Wu Chunzhi1，Gu Fugen1，Shi Shuai2，Meng Gendalai1，Wang Yi1，Zhang Aiwu1
(1．Department of Pharmacy，Affiliated Hospital，Neimenggu Medical College，Huhehaote，Neimenggu，China010050;2．School of Pharmacy，Neimenggu Medical College，Huhehaote，Neimenggu，China010010)

ObjectiveTo study a new extraction process of total flavones from Hippophae(TFH)fructus with β-cyclodextrin(CD);Methods With β-CD as auxiliary material，TFH in Hippophae fructus was extracted;The total extraction amount and extraction rate of TFH as well as their percent content in the extract were simultaneously determined and compared with those from the traditional extraction processes such as the ethanol extraction and water extraction process;ResultsThe total extraction amount and extraction rate of TFH as well as their percent content in the extract from the new extraction process was nearly close to those from the ethanol extraction process，but the new process was significantly better than the water extraction method(P＜0;05);ConclusionThe new extraction process with β-CD as auxiliary material is of low cost，high safety，pollution-free and might has the important application prospects;

Hippophae fructus;total flavones;β-CD;complexation;extraction process;UV

TQ461;R284．1;R282．71

A

1006-4931(2012)14-0065-03

吳春芝(1968-)，女，大學(xué)本科，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)以及環(huán)糊精包合物，(電話)0471-6637633(電子信箱) fgczh@sina;com;谷福根(1967-)，男，博士研究生，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)糊精包合物及藥物新劑型研究工作，本文通訊作者，(電話)0471-6637091(電子信箱)fgczh@sina;com。

2011-08-09)