大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究

吳海霞

(寧波鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院，浙江寧波315200)

大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究

吳海霞

(寧波鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院，浙江寧波315200)

目的優(yōu)選D-101大孔樹脂精制杭白菊總黃酮工藝中的最佳上樣條件。方法將影響樹脂吸附性能的3個(gè)因素上樣量、流速和pH設(shè)計(jì)成3因素3水平試驗(yàn)，采用L9(34)表正交試驗(yàn)，以樹脂吸附總黃酮含量、乙醇洗脫總黃酮含量和固體總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最佳條件。結(jié)果確定最佳上樣條件為上樣量20 mL、pH為5、流速2 BV/h。結(jié)論該最佳上樣條件可應(yīng)用于大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究。

杭白菊;總黃酮;正交試驗(yàn)法;上樣條件;大孔樹脂

杭白菊Chrysanthemum morifolium Ramat;是一種常用中藥，產(chǎn)于浙江桐鄉(xiāng)、海寧、嘉興等地，為“浙八味”之一，具有散風(fēng)清熱、平肝明目的功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花［1］。還可抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抗艾滋?。?］、治療心血管?。?-6］。杭白菊含有多種揮發(fā)油、黃酮(香葉木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷、金合歡素-7-O-β-D葡萄糖苷［7］)、菊苷等成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，杭白菊揮發(fā)油解熱、總黃酮降壓是其散風(fēng)清熱、平肝明目的藥理學(xué)基礎(chǔ)之一［8］。因此，揮發(fā)油和總黃酮是其發(fā)揮藥效作用的主要有效成分。為了提高杭白菊總黃酮的提取率，筆者采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以杭白菊總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出杭白菊總黃酮的最佳上樣條件?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

D-101大孔樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司，批號(hào)為100807);BS110型萬(wàn)分之一天平(北京賽多利天平有限公司); SKS200H超聲儀(華南超聲設(shè)備廠);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);UV-VIS 8500型紫外可見分光光度計(jì)(天津市拓普儀器有限公司)。菊花(浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠);蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品15;3 mg，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得0;153 0 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。取杭白菊30 g精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中。加入16倍量、90%的乙醇?；亓魈崛?次，每次1;5 h。每次提取前冷浸30 min，最后合并濾液，即得樣品溶液。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1，3，5，7，9，11 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加入30%乙醇至12;5 mL，加入0;7 mL NaNO2 (1∶20)，搖勻，放置5 min后加入0;7 mL Al(NO3)2(1∶10)，6 min后再加入5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，混勻，以相應(yīng)試劑作空白，10 min后于516 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=8;840 9 C-0;001 3，r=0;999 8 (n=6)。

2．3 總黃酮測(cè)定

精密吸取樣品溶液0;5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加10% Al(NO3)2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑作為空白，在516 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總黃酮含量。精密吸取洗脫液10 mL于已恒重的燒杯內(nèi)，蒸干，放入58℃恒溫干燥箱內(nèi)，烘干至恒重。計(jì)算固體總黃酮含量。

2．4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇樣品上樣量(因素A，mL)、pH(因素B)、洗脫流速(因素C，BV/h)3個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)。以吸附率、洗脫率、總固物含量為考察指標(biāo)進(jìn)行考察。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2．5 D－101樹脂的吸附、洗脫試驗(yàn)

取10 mL選定樹脂，加95%乙醇浸泡過夜，傾去乙醇，加蒸餾水20 mL，三角燒瓶外作標(biāo)記，浸泡1 h，重復(fù)多次至基本無(wú)醇味。將處理過的樹脂濕法上柱，原柱中有5 mL蒸餾水，注意不要攪拌，用吸管，動(dòng)作輕，防止樹脂變細(xì)。然后，放出蒸餾水至液面高出柱床1 mm，用蒸餾水再洗1 BV，摸索流速。按表1所示上樣條件進(jìn)行上樣吸附，收集流出液。用蒸餾水洗脫至HCL-Mg反應(yīng)陽(yáng)性，再用40%乙醇進(jìn)行洗脫至洗脫液無(wú)色，并收集洗脫液。利用紫外分光光度法測(cè)定流出液和洗脫液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度。按吸附率=(C樣品液-C流出液)/C樣品液× 100%，洗脫率=C洗脫液×25/［(C樣品液-C流出液)×25］×100%，計(jì)算結(jié)果。

2．6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

杭白菊總黃酮提取正交試驗(yàn)中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3、表4、表5?？梢?，從吸附率結(jié)果可知A1B1C3為最佳吸附條件，從洗脫率和總固物率可見A3B1C3為最佳條件。從各個(gè)方差分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)吸附率而言，因素A并沒有顯著性差異，從表3中也可看出各個(gè)A值的K1，K2，K3之間相差不大，故最佳條件為A3B1C3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 吸附率方差分析結(jié)果

表4 洗脫率方差分析結(jié)果

表5 總固物方差分析結(jié)果

2．7 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用最佳上樣條件，按2;5項(xiàng)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表6?？梢?，RSD遠(yuǎn)小于3%，準(zhǔn)確度很高。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隨著樣品上樣量的增加，樹脂對(duì)樣品的吸附率降低。在一定上樣量條件下，吸附率隨流速的增加而降低。樣品溶液的pH對(duì)吸附也有較大影響，但無(wú)明顯的規(guī)律性。結(jié)果表明，紫外-可見分光光度法測(cè)定杭白菊總黃酮的含量操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。最佳上樣條件為A3B1C3，即上樣量20 mL、pH=5、流速2 BV/h。從洗脫率的方差分析可知，各個(gè)因素對(duì)洗脫率并沒有顯著性的影響，可以推斷這個(gè)指標(biāo)的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有意義，以后進(jìn)一步研究杭白菊總黃酮時(shí)應(yīng)考慮是否選更具代表性的指標(biāo)。由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，3次試驗(yàn)結(jié)果明顯優(yōu)于其他9組試驗(yàn)，說明該最佳上樣條件穩(wěn)定可行，可用于大孔樹脂精制杭白菊總黃酮。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì);中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］;北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:292;

［2］張爾賢，方黎，張捷，等;菊花提取物的抗氧化活性研究［J］;食品科學(xué)，2000，21(7):6 291;

［3］Wang HK，Xia Y，Yang ZY，et al;Recent advances in the discovery and evelop-ment of flavonoids and their analogues as antitumor and anti-HIV agents［J］;Adv Exp Med Bio，1998，439:191-225;

［4］Hu CQ，Chen K，Shi Q，et al;Anti-AIDS agents，10'acacetin-7-O-β-D-galactopy-ranoside，an anti-HIV principle from Chrysanthe-mum morifolium and a structure-activity correlation with some related flavoids［J］;J Nat Prod，1994，57(1):422-511;

［5］浙江醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研組;菊花制劑對(duì)冠脈作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］;浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1978，7(4):52-58;

［6］楊學(xué)運(yùn)，孫孔富，奚毓妹，等;中藥杭白菊酚性部分的藥理作用探討［J］;浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，18(6):28-31;

［7］賈凌云，孫啟時(shí)，黃順旺;滁菊花中黃酮類化學(xué)成分的分離與鑒定［J］;中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2003，13(3):159-161;

［8］戴敏，劉青云，李道中，等;菊花解熱、降壓作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究［J］;中藥材，2001，24(7):505-506;

Study on Sampling Conditions of Refining Chrysanthemum Total Flavonoids with Macroporous Resin

Wu Haixia
(Zhenhai District Longsai Hospital，Ningbo，Zhejiang，China315200)

ObjectiveTo optimize D-101 macroporous resin for obtaining the best sampling conditions to refine chrysanthemum total flavonoids;Methods3 factors influencing resin adsorption ability，the sample volume，flow rate and sample solution pH value，were designed to the 3 factors 3 levels test;Adopting the L9(34)table orthogonal experiment，the total flavonoid content by resin adsorption，total flavonoids content by ethanol eluting and solid total flavonoid content were used as the evaluation indexes for screening the best conditions;ResultsThe best optimum sampling conditions were A3B1C3，i;e;，the sample volume of 20 mL，pH 5 and thevelocity of 2 BV/h; ConclusionThe best sampling conditions can be used in the sampling condition study for refining chrysanthemum total flavonoids by macroporous resin;

chrysanthemum;total flavonoids;orthogonal test;sampling condition;macroporous resin

TQ461;R284．2;R284．1

A

1006-4931(2012)14-0067-03

2011-10-28)