紫地榆中總鞣質(zhì)的含量測定

駱婷婷，藍 海，張海珠，謝雪寶，胡建勇，周 萍*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理州食品藥品檢驗所，云南大理 671000）

紫地榆中總鞣質(zhì)的含量測定

駱婷婷1，藍 海1，張海珠1，謝雪寶1，胡建勇2，周 萍1*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理州食品藥品檢驗所，云南大理 671000）

目的：建立紫地榆總鞣質(zhì)的含量測定方法。方法：以沒食子酸為對照品，采用比色法測定紫地榆總鞣質(zhì)的含量。結(jié)果：以沒食子酸計，紫地榆鞣質(zhì)濃度在2.03～12.17 μg∕mL范圍內(nèi)與吸光度成良好的線性關(guān)系（r=0.999 4）；平均加樣回收率為99.1%，RSD為2.32%（n=8）。結(jié)論：該方法簡便快速準確，可用于紫地榆總鞣質(zhì)的含量測定。

紫地榆；總鞣質(zhì)；沒食子酸；比色法

紫地榆（赤地榆）（Geranium strictipes）是牻牛兒苗科老鸛草屬植物（Geranium strictipes R.Knuth）的根，民間稱隔山消〔1〕，主要分布于云南中甸、永寧、永勝、大理等地區(qū)，其藥源豐富，長期以來在云南的白族、彝族等地區(qū)廣泛使用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)該屬植物具有抗菌消炎、抗病毒、抗肝損傷、止咳、抗氧化、抗癌以及孕激素樣等多種作用〔2〕，近年研究發(fā)現(xiàn)紫地榆水提取物對牙周致病厭氧菌有較好的抑制作用〔3〕，藍海等〔4〕發(fā)現(xiàn)五倍子和隔山消對牙齒具有保護作用，隔山消效果不如五倍子。紫地榆中含有β-1，4，6-三-O-沒食子酰基-葡萄糖、β-1，6-二-O-沒食子?；?葡萄糖、鞣花酸、五倍子酸甲酯、沒食子酸、（+）-兒茶素等鞣質(zhì)類和酚酸類成分3，4-二羥基苯甲酸〔5〕，關(guān)于含量測定方面，僅有肖培云等〔6〕用HPLC法測定隔山消中沒食子酸的含量。鞣質(zhì)被認為是天然的抗氧化劑，近年來越來越多的研究表明鞣質(zhì)具有較好的抗腫瘤活性〔7〕。本實驗對紫地榆的總鞣質(zhì)含量進行測定，為控制紫地榆藥材質(zhì)量提供參考，為開發(fā)利用紫地榆提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；T6新世紀-紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SB25-12D超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司500 W，35 KHz）；FA2004N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SSY-4電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）；電子萬用爐（天津市泰斯特儀器有限公司1 000 W）。

1.2藥品與試劑紫地榆藥材于2012年4月購于大理藥材市場，由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院周濃老師鑒定為牻牛兒苗科老鸛草屬植物的根。沒食子酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13040103，含量測定用）；鎢酸鈉（天津市百世化工有限公司，20090818）；鉬酸鈉（天津市化學(xué)試劑四廠，20041015）；硫酸鋰（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；無水碳酸鈉（江蘇強盛化工有限公司，20081227）；干酪素（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，批號：20081013）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品50.70 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.507 mg∕mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50.7 μg∕mL的沒食子酸對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 紫地榆藥材粉碎后過4號篩，取樣0.4 g，精密稱定，置250 mL棕色量瓶中，加150 mL水，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置（使固體物沉淀），濾過，棄去50 mL初濾液，精密移取20 mL續(xù)濾液，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得〔8〕。

2.1.3 磷鉬鎢酸試液的制備 取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL，液溴0.2 mL，混勻，充分反應(yīng)，煮沸除去殘留的溴（約15 min），冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色（如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多余的溴即可）。

2.2測定波長的選擇采用磷鉬鎢酸-碳酸鈉比色法。分別精密吸取沒食子酸對照品溶液和供試品溶液2.0 mL置于25 mL棕色量瓶中，加1.0 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加入10 mL的水，用29%碳酸鈉溶液定容，搖勻，放置10 min，以試劑空白為參比，在400～900 nm間進行波長掃描，測定其最大吸光度。結(jié)果顯示沒食子酸對照品溶液和供試品溶液在765 nm處均有最大吸光度，故選擇765 nm為測定波長。

2.3總鞣質(zhì)的計算

2.3.1 總酚 取樣品約0.4 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下方法測定其吸光度，用標準曲線計算供試品溶液中總酚的量。

2.3.2 不被吸附的多酚 精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置25 mL棕色量瓶中，照“2.2”項下的方法測定其吸光度，用標準曲線計算供試品溶液中不被吸附的多酚含量。

按下式計算總鞣質(zhì)的含量〔9〕：總鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量

2.4顯色條件考察

2.4.1 顯色劑的量考察 分別精密量取2.0 mL供試品溶液，置25 mL棕色量瓶中，分別加入0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的磷鉬鎢酸試液，再加入10.4、10.2、10.0、9.8、9.6、9.4 mL水，用29%碳酸鈉定容，搖勻，放置30 min，以試劑空白為參比，在765 nm的波長處測定其吸光度。

由結(jié)果可知，樣品的吸光度隨著顯色劑量的增加而升高，當顯色劑的量加到1.0 mL時，樣品的吸光度隨著顯色劑量的增加變化不明顯，故選擇顯色劑磷鉬鎢酸的加入量為1.0 mL。

2.4.2 放置時間對樣品吸光度的影響 精密量取樣品溶液2.0 mL置于25 mL棕色量瓶中，加入1.0 mL磷鉬鎢酸試液，再加入10 mL水，用29%碳酸鈉溶液定容，搖勻，分別放置10、20、30、40、50 min，以試劑空白為參比，在765 nm處測定其吸光度。

結(jié)果顯示，放置10～50 min吸光度無太大變化，說明放置時間對樣品的吸光度影響不明顯，因此放置時間為10 min測定即可。

2.5線性關(guān)系考察精密量取沒食子酸對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入1.0 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加入11.0、10.0、9.0、8.0、7.0、6.0 mL水，用29%碳酸鈉定容，搖勻，放置10 min，以試劑空白為參比，在765 nm的波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，得到回歸方程：Y=0.003 6X+0.051 5，r=0.999 4。結(jié)果表明沒食子酸在2.03～12.17 μg∕mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗精密移取對照品溶液2.0 mL于25 mL棕色量瓶中，按“2.2”項下方法，在765 nm處連續(xù)測定其吸光度，得RSD為1.04%（n=6）。

2.7供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液分別在0.5、1、2、4、6、9、12、24 h時間點取樣，按“2.2”項下方法測定吸光度，得RSD為1.35%。實驗結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8重復(fù)性實驗取同一批藥材粉末6份，每份約0.4 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定并計算樣品中總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果為0.252 mg∕g，RSD為2.57%（n=6）。

2.9回收率試驗精密稱取已知含量的紫地榆為0.252 mg∕g的樣品8份，每份約0.2 g，加沒食子酸對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定并計算樣品中總鞣質(zhì)的加樣回收率。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=8）

2.10樣品測定平行取樣6份，每份約0.4 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定并計算樣品中總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果樣品中總鞣質(zhì)的含量為0.256 mg∕g，RSD=2.13%（n=6）。

3 討論

由于鞣質(zhì)受熱不穩(wěn)定，故不能加熱回流提取，采用冷浸過夜超聲提取，能把總鞣質(zhì)提取完全。鞣質(zhì)的測量方法有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡(luò)合滴定法、比色法。皮粉法適用廣泛，但供試品的耗用量大、測定周期較長、選擇性相對較差，適合用于中藥中含有較豐富的鞣質(zhì)的含量測定，含量較低的則不適合用皮粉法測定。干酪素法能有選擇地測出具有生理活性的鞣質(zhì)〔10〕，并且干酪素對鞣質(zhì)的吸附專屬性強，效果優(yōu)于皮粉法，適合用于中藥中含有少量鞣質(zhì)的測量。比色法的優(yōu)點是操作簡單，經(jīng)顯色劑顯色后靈敏度較高。在實驗中，因鞣質(zhì)含有的多酚羥基與磷鉬鎢酸試液反應(yīng)生成的藍色產(chǎn)物遇光不穩(wěn)定，因此顯色反應(yīng)條件應(yīng)該避光操作，使用棕色量瓶。

〔1〕藍海，李龍星，肖培云.紫地榆中沒食子酸的提取工藝研究〔J〕.中成藥，2009，31（9）：1456-1457.

〔2〕朱永紅，呂盼.民族藥紫地榆研究進展〔J〕.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35（3）：20-23.

〔3〕李龍星，郭利軍，藍海.紫地榆對口腔致齲菌抑制作用的研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（36）：20600.

〔4〕藍海，羅常輝.隔山消和五倍子水提物對牛切牙脫礦與再礦化的動力學(xué)研究〔J〕.中成藥，2011，33（4）：692-694.

〔5〕楊國紅，陳道峰.紫地榆的化學(xué)成分及其抗艾滋病病毒活性〔J〕.中草藥，2007，38（3）：352-354.

〔6〕肖培云，藍海，李龍星.HPLC法測定隔山消中沒食子酸的含量研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報，2009，8（6）：9-11．

〔7〕王添敏，孫曉麗，彭雪，等.胡桃楸的根、莖枝、葉和果皮中總鞣質(zhì)的含量測定〔J〕.中國中藥雜志，2011，36（1）：32-36.

〔8〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔S〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄62.

〔9〕李嬈嬈，吳麗莎，原思通.兩種方法測定槐花3種飲片中鞣質(zhì)含量〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（10）：2345-2346.

〔10〕曾祥麗，丁安偉，單鳴秋.側(cè)柏葉炮制前后鞣質(zhì)的含量測定〔J〕.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（4）：45-46.

*通信作者：周萍，教授.

（責(zé)任編輯 李 楊）

Determination of Total Tannins in Geranium strictipes

LUO Tingting1,LAN Hai1,ZHANG Haizhu1,XIE Xuebao1,HU Jianyong2,ZHOU Ping1*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China;2.Dali Institute for Food and Drug Control,Dali, Yunnan 671000，China）

Objective:To establish a method for the determination of total tannins in Geranium strictipes.Methods:With Gallic acid as reference substance,the UV spectrophotometer was adopted to determine the content of total tannins.Results:With Gallic acid as a standard,Tannins of Geranium strictipes showed good linear relationship in the range of 2.03-12.17 μg∕mL（r=0.999 4）.The average recovery was 99.1%,RSD was 2.32%（n=8）.Conclusion:The method was simple,rapid and accurate,which could be used to measure the content of tannins in Geranium strictipes.

Geranium strictipes;total tannins;Gallic acid;colorimetric method

R284

A

1672-2345（2014）02-0012-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.02.005

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260512）

2013-11-14

2013-12-09

駱婷婷，碩士研究生，主要從事藥物質(zhì)量研究.