丹紅注射液調(diào)節(jié)大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠血清氨基酸代謝譜的實(shí)驗(yàn)研究

郭志麗朱 妍，2肖紅斌王 忠

（1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700；2陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安，712000；3中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連，116023）

丹紅注射液調(diào)節(jié)大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠血清氨基酸代謝譜的實(shí)驗(yàn)研究

郭志麗1朱 妍1，2肖紅斌3王 忠1

（1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700；2陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安，712000；3中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連，116023）

目的：利用代謝組學(xué)手段檢測(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型大鼠血清中氨基酸含量，微觀上闡明氨基酸注射液的療效以及部分作用機(jī)制。方法：采用鄰苯二甲醛（O-Phthalaldehyde，OPA）柱前在線衍生反相高效液相色譜法，采用熒光檢測(cè)，梯度洗脫，建立了血清中氨基酸代謝譜的相對(duì)定量分析方法，測(cè)定36例大鼠血清中的15種氨基酸含量。流動(dòng)相A為10 mol/LNa2HP04-Na2B07緩沖液（pH＝7.95），B為乙腈-甲醇-水（45∶45∶15，V/V/V），線性梯度洗脫，流動(dòng)相B在6 min內(nèi)由5%增加至17.2%，6～35 min內(nèi)由17.2%增加至52%。結(jié)果：1）該法在35 min之內(nèi)分離出15種氨基酸；2）經(jīng)主成分分析，3個(gè)組在空間上得到很好地分離，氨基酸代謝譜發(fā)生了一定的變化；3）利用SPSS方差分析，有6個(gè)氨基酸在分離各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：丹紅注射液通過部分調(diào)節(jié)MCAO攝動(dòng)通路改善腦梗死大鼠血清部分氨基酸的代謝趨勢(shì)。

高效液相色譜；氨基酸代謝組學(xué)；腦梗死；絲氨酸代謝

氨基酸作為代謝網(wǎng)絡(luò)中重要的代謝物，與腦梗死存在相關(guān)性［1］。腦梗死的病理生理機(jī)制尚不清楚，應(yīng)用代謝組學(xué)的科學(xué)性，通過數(shù)學(xué)建模用于研究藥物靶標(biāo)和數(shù)據(jù)挖掘很有意義［2］。氨基酸代謝系統(tǒng)分析，在生物學(xué)研究當(dāng)中是一個(gè)主要范例，將幫助我們確定新的藥物靶點(diǎn)反過來又會(huì)更深入了解腦梗死的產(chǎn)生機(jī)制，從而更好的指導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)［3］。本實(shí)驗(yàn)通過氨基酸類代謝譜的代謝組學(xué)法，建立了血清氨基酸代謝譜柱前在線衍生化HPLC-FLD方法，應(yīng)用了代謝組學(xué)使用的超高效液相色譜結(jié)合模式識(shí)別方法的平臺(tái)，用于研究代謝和疾病的相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集與預(yù)處理

1.1.1 造模方法 參照Longa等的線拴法，略做改進(jìn)。用15%水合氯醛（4mL/kg，ip）麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠仰臥位固定，消毒皮膚，鋪無菌洞巾，近正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉切口處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線約（18.5±0.5）mm，感覺有阻力即達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，完全阻斷其血流，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈。所用栓線為直徑0.2 mm尼龍漁線。頭段燒圓，頂端直徑約（0.25～0.28）mm。術(shù)中室溫在（27±0.5）℃，術(shù)中用白熾燈加溫，輔助電熱毯保溫，維持大鼠肛溫約37℃。術(shù)后縫合傷口，動(dòng)物回籠1 h后拔出漁線，即造成缺血再灌注模型［3］。以MCAO大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，空白對(duì)照組9只，模型組6只，丹紅注射液給藥組21只（DH1＝1 mg/kg，DH2＝2.5 mg/kg，DH3＝5 mg/kg，DH4＝10 mg/kg），分別于造模后3 d，3次給藥，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的藥物劑量，于鼠尾靜脈注射給藥。第3 d給藥處死后，腹腔靜脈取血，靜置后取血清離心取得血清500μL/只，于超低溫（-80℃）保存造模成功后，取血清并于超低溫保存。

精密量取血清樣品150μL，加入純水800μL，內(nèi)標(biāo)溶液（正纈氨酸250 ng/mL）150μL，混勻取上清液200μL，加入85%甲醇800μL，渦旋混合震蕩5 min，于4℃靜置1 h，離心（12 000 r/min 15 min），取上清液200μL，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，裝于液相小瓶中進(jìn)行在線衍生HPLC-FLD方法檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)，配備可變波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。氨基酸對(duì)照品：出峰順序：氨基酸對(duì)照品：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、色氨酸（TRP）、絲氨酸（SER）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、?；撬幔═au）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、鳥氨酸（Orn）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys），正纈氨酸（Nor）購于美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純，國(guó)產(chǎn)分析純；OPA 3-巰基乙酸（美國(guó)Accostandard公司）；乙腈和甲醇為色譜純；Milli-Q超低有機(jī)物超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水，實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所進(jìn)行。丹紅注射液原液的來源（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供）。

1.3 在線衍生化方法 OPA為衍生試劑：量取OPA儲(chǔ)備液（10 mg/mL）1 mL，加入硼酸鹽緩沖液（pH＝10.2）1 mL，再加入3-巰基乙醇（3-MPA）100μL，混勻后，用0.22μm濾膜過濾，待用。衍生化過程在Agilent1200自動(dòng)進(jìn)樣器上在線自動(dòng)完成。。衍生化過程在Agi1ent1200自動(dòng)進(jìn)樣器上在線自動(dòng)完成，程序如下：吸取磷酸鹽緩沖液（pH＝15.2）50μL；吸取樣品、OPA衍生試劑各5μL，充分混合5次，等待1 min，進(jìn)樣。

1.4 血清氨基酸高效液相色譜分析 色譜條件樣品室溫度設(shè)為5℃；Hypersil C18反相色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm，大連依利特公司）；流動(dòng)相A液：15 mmol/L Na2HPO4-Na2B4O7pH＝7.95緩沖液，B液為乙腈：甲醇：水（體積比為45∶45∶15）。梯度洗脫條件是梯度洗脫：流動(dòng)相B在6 min內(nèi)由5%增加至17.2%，6～35 min內(nèi)由17.2%增加至52%；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm（譜帶寬10 nm），參考波長(zhǎng)390 nm（譜帶寬15 nm）。進(jìn)樣量為5μL［4］。

2 方法學(xué)考察

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 在0.05～150 mg/mL濃度范圍內(nèi)，將15種氨基酸分別按照5μg/m L、15μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL、150μg/mL的濃度配置成5個(gè)等級(jí)的液相小瓶，每個(gè)μg級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品配成兩瓶，每個(gè)樣品進(jìn)針3次。由5個(gè)濃度水平來繪制校正曲線。以峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做校正曲線，得回歸方程。15種氨基酸峰面積和濃度之間的線性相關(guān)系數(shù)r值在0.953 4～0.999 2之間。

圖1 PCA空白組（C）和模型組（M），給藥組（T）血清樣品散點(diǎn)分布圖（t［Comp.1］/t［Comp.2］）圖中標(biāo)準(zhǔn)分組

圖2 空白組（C）和模型組（M），給藥組（T）血清樣品PCA3D分布圖（t［Comp.1］/t［Comp.2］）

圖3 聚類分析熱圖

2.2 精密度試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)5次進(jìn)樣，15種氨基酸的保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)分別為0.09%～0.28%和0.8%～4.2%。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取15份樣品依法進(jìn)行測(cè)定，日內(nèi)、日間變異系數(shù)均＜7.5%。

2.4 加樣回收率試驗(yàn) 3個(gè)空白樣品中添加低、中、高三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品完成，通過對(duì)比檢測(cè)的量和實(shí)際加入的量來計(jì)算，結(jié)果平均回收率在89.2%～152.6%之間。

表1 對(duì)區(qū)分對(duì)照組、模型組、治療組大鼠有顯著貢獻(xiàn)的差異代謝物

圖4 上述差異代謝物在4組大鼠血清中的含量變化趨勢(shì)

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC數(shù)據(jù)分析結(jié)果 用此方法測(cè)定了36例大鼠血清氨基酸代謝譜，將峰面積數(shù)據(jù)化，采用安捷倫自帶分析軟件對(duì)樣品氨基酸峰面積進(jìn)行自動(dòng)積分，如果未在響應(yīng)值范圍之內(nèi)進(jìn)行手動(dòng)積分，得出峰面積結(jié)果。將各個(gè)氨基酸峰面積值除以內(nèi)標(biāo)面積值，以減少誤差，用于最終統(tǒng)計(jì)。以相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù)，通過吸光度與濃度值建立了回歸曲線。將積分值進(jìn)行中心化和比例換算，用Simca-P12.0（UmetricsAB，Umea，Sweden）軟件進(jìn)行PCA分析，求出主成分（Principal Components，PC），利用PCA對(duì)各組大鼠血清的氨基酸圖譜進(jìn)行分析。如圖1與圖2所示，治療組與空白對(duì)照組、模型組在平面圖和三維圖上均得到了很好的分離，說明3個(gè)組在代謝圖譜上產(chǎn)生了一定的差異。

3.2 MCAO大鼠血清差異氨基酸含量變化 為考察丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠血清代謝譜的影響，同樣對(duì)對(duì)照組、模型組和治療組3組大鼠進(jìn)行差異代謝物篩選。MCAO大鼠經(jīng)丹紅注射液給藥干預(yù)后，其血清代謝輪廓較模型組趨近于正常對(duì)照組，表明丹紅注射液對(duì)大鼠整體的代謝通路起到了一定的調(diào)節(jié)作用，使之往正常水平變化。經(jīng)SPSS軟件分析，如表1顯示，絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酸以及谷氨酸等代謝物對(duì)分類起了重要作用。

3.3 丹紅注射液干預(yù)作用差異的探討與差異代謝物解釋 圖4 A為上述差異代謝物在4組大鼠血清中的含量比較。在MCAO大鼠血清中，絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸含量均顯著性降低（t檢驗(yàn)，P＜0.05），而谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸含量則顯著性升高（P＜0.05）。而藥物組則顯著下調(diào)了谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和上調(diào)了絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸。MCAO大鼠經(jīng)丹紅注射液干預(yù)后，PCA得分圖顯示其整體代謝輪廓往正常大鼠方向偏移，說明MCAO引起紊亂的代謝通路整體上得到了調(diào)節(jié)，丹紅注射液可以在一定程度上改善大鼠MCAO的狀態(tài)。圖4 B為6個(gè)氨基酸在各個(gè)組的含量變化趨勢(shì)，提示隨著劑量的上升，氨基酸的含量趨向于空白對(duì)照組。

3.4 差異代謝物的作用方式 經(jīng)過檢索HMDB得出生物學(xué)意義，天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）屬于興奮性氨基酸，在腦缺血區(qū)域產(chǎn)生興奮毒性，而絲氨酸（Ser）及其代謝產(chǎn)物在生物體新陳代謝以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮的特定功能是必不可少的［5］，如圖5顯示，人體內(nèi)與絲氨酸相關(guān)的代謝物，其中前六位正是檢測(cè)出來的6個(gè)差異代謝物，提示差異代謝物與絲氨酸代謝相關(guān)且在細(xì)胞增殖以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)上有著特定功能。前期研究提示，在精神疾病患者和嚴(yán)重的絲氨酸合成障礙的神經(jīng)系統(tǒng)異常的患者中發(fā)現(xiàn)了絲氨酸以及甘氨酸含量的改變，這一發(fā)現(xiàn)均證明了絲氨酸在大腦發(fā)育和功能的重要性［6-7］，可以做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這些目標(biāo)生物標(biāo)記物質(zhì)的存在。

圖5 與絲氨酸相關(guān)的氨基酸代謝物

絲氨酸高度集中在所有細(xì)胞膜，其合成來自四個(gè)可能的來源：飲食攝入；生物糖酵解中間產(chǎn)物三磷酸甘油酸酯降解；甘氨酸轉(zhuǎn)化；蛋白質(zhì)和磷脂降解。在生物合成途徑中，糖酵解中間產(chǎn)物三磷酸甘油轉(zhuǎn)化為磷酸稀式丙酮酸，在三磷酸甘油酸鹽脫氫酶以及轉(zhuǎn)氨酶的催化反應(yīng)下，磷酸絲氨酸由磷酸絲氨酸磷酸酶轉(zhuǎn)化為絲氨酸。蘇氨酸在哺乳動(dòng)物中的分解代謝似乎主要是由活動(dòng)的蘇氨酸脫氫酶氧化蘇氨酸，形成氨酸和乙酰輔酶a。蘇氨酸血清濃度增加會(huì)直接導(dǎo)致蘇氨酸和甘氨酸在大腦中積累產(chǎn)生毒性［8-9］。

“BCAA”是指纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸是支鏈氨基酸。纈氨酸缺乏是以大腦神經(jīng)缺陷為標(biāo)志，許多類型的BCAA先天性代謝存在的各種異常情況都關(guān)聯(lián)到一系列普遍的癥狀，比如精神發(fā)育遲滯，共濟(jì)失調(diào)，低血糖，脊髓肌肉萎縮，皮疹，嘔吐和過度的肌肉運(yùn)動(dòng)等［10］。

4 結(jié)論

通過分析各個(gè)差異代謝物質(zhì)在大腦中的發(fā)生作用的方式得出結(jié)果，丹紅注射液牽連效應(yīng)可能是通過介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。這些結(jié)果表明，丹紅注射液療效發(fā)生在代謝系統(tǒng)的多個(gè)方面。

丹紅注射液是目前國(guó)內(nèi)銷量最大的中藥注射劑，通過微觀分析來看它可以調(diào)節(jié)一些在病理狀態(tài)下出現(xiàn)差錯(cuò)的小分子［12-13］，也可以加強(qiáng)一些特異分子向健康狀態(tài)下轉(zhuǎn)變過程的轉(zhuǎn)換作用，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用研究會(huì)增加我們理解腦梗死病理生理過程［14］，這應(yīng)該會(huì)幫助我們識(shí)別潛在的生物標(biāo)記物來開發(fā)新的治療策略，進(jìn)而澄清藥物的通路和途徑，幫助指導(dǎo)臨床試驗(yàn)預(yù)測(cè)，解釋觀察藥物作用機(jī)制，能使我們?cè)黾訉?duì)代謝組學(xué)的掌控能力。

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（2013-07-22收稿 責(zé)任編輯：王明）

Research on Danhong Injection Ad justing Metabolic Spectrum of Serum Amino Acid in Cerebral Infarction Rats

Guo Zhili1，Zhu Yan1，2，Xiao Hongbin3，Wang Zhong1
（1 China Academy of Chinese Medical Science，Beijing 100700，China；2 Xi'an BUCHANG Pharmaceutical Co．，Ltd．Xi'an 712000，China；3 Dalian Chemical Physics Institute，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China）

Objective：To determine the content of amino acid to clarify the curative effect and the functioning mechanism of DanHong injection on microscopic.Methods：OPA reversed phase high performance liquid chromatography（HPLC），precolumn derivatization method fluorescence detection，gradient elution were used.Mobile phase A was 15mol/LNa2HP04-Na2B07buffer（pH＝7.95），B was acetonitrile-methanol-water（45：45：15，V/V/V）.As for linear gradient elution，mobile phase B in 6min increased from 5%to 17. 2%，increased from 17.2%to 52%in 6-35min.Results：1）Fifteen kinds of amino acids were isolated within 35 min；2）using principal component analysis，three groups were well separated；3）using the SPSS analysis of variance，there were six amino acids in the separation between groups was statistically significant.Conclusion：Danhong injection can improve metabolic trend of amino acid in cerebral infarction rats serum through adjusting perturbed pathways

HPLC；Amino acid；Cerebral infarction；Serine metabolism；Metabolomics

R285.5；R743.3

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.031