回流法提取銀杏葉總黃酮的研究

李新舟，張懷宇，許友玲

（福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)系，福建 泉州362332）

銀杏體內(nèi)含有許多生物活性物質(zhì)，可以抵御昆蟲、細(xì)菌和真菌的侵入，銀杏葉在中國(guó)作為傳統(tǒng)的中草藥已經(jīng)有幾千年的歷史，受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的高度重視［1］。

早在20世紀(jì)60年代初，干銀杏葉的丙酮－水（60∶40）提取物被用于治療腦部供血不足，取得了非常顯著的療效且沒(méi)有明顯的副作用［2］。此后，其它國(guó)家相繼致力于銀杏制品的開發(fā)?，F(xiàn)代科學(xué)研究證明，銀杏葉含有200多種藥用成分，其中黃酮和萜內(nèi)酯是銀杏葉中兩類重要的生理活性物質(zhì)，具有捕獲自由基，抑制血小板活化因子，預(yù)防和治療心、腦血管疾病、老年癡呆，擴(kuò)張血管、降低血脂、抗衰老等藥理作用［3－4］。進(jìn)一步研究表明，銀杏葉提取物還具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗寄生生物、抗病毒活性［5］。

近年來(lái)，銀杏葉制劑與銀杏葉粗提取物越來(lái)越多地用于保健食品及飲品。作者用乙醇回流法提取銀杏葉總黃酮，考察料液比（g∶mL，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了銀杏葉總黃酮提取工藝，并進(jìn)一步研究了微波輔助對(duì)銀杏葉總黃酮提取的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

銀杏葉，山東臨沂郯城。

槲皮素對(duì)照品；無(wú)水乙醇（AR），石油醚，5%亞硝酸鈉，4%氫氧化鈉，10%硝酸鋁，4%鹽酸，蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉粉末的制備

將銀杏葉清洗干凈后于70℃烘干5～6h，然后用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。取適量的銀杏葉粉末用石油醚于50℃回流提取，去脂除雜，過(guò)濾，將濾渣風(fēng)干，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10mg槲皮素對(duì)照品，配制成0.1mg·mL－1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL分別置于50mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加0.5mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置5min后加0.5mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min后加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置5～10min后測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)、槲皮素質(zhì)量濃度（c）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定

銀杏葉中總黃酮類活性成分的測(cè)定采用NaNO2－A1（NO3）3－NaOH絡(luò)合－分光光度法。取0.5mL樣品于25mL容量瓶中，分別加入0.5mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5min后加0.5mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min后加10mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置5～10min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，按下式計(jì)算銀杏葉總黃酮提取率［［7－8］：

式中：c為總黃酮濃度，g·mL－1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.0g樣品粉末，置于磨口錐形瓶中，按不同的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇、在一定溫度下回流提取一定時(shí)間。抽濾，濾液離心，取上清液0.5mL，按照1.2.3方法測(cè)定吸光度，計(jì)算銀杏葉總黃酮提取率。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)［9］。以料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察因素，采用4因素3水平進(jìn)行L16（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化銀杏葉總黃酮的提取工藝［10－12］，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 微波輔助提取方法

準(zhǔn)確稱取1.0g樣品粉末，置于磨口錐形瓶中，按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的料液比加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇。選擇5種不同微波功率進(jìn)行間歇式提取15次，每次10s。測(cè)定銀杏葉總黃酮的含量，考察間歇式微波輔助提取對(duì)提取率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，按1∶25、1∶35、1∶40、1∶50和1∶55的料液比加入50%乙醇，在60℃下回流提取3.0h，經(jīng)純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，總黃酮提取率隨著料液比的減?。刺崛┯昧康脑黾樱┒龃?，料液比為1∶50時(shí)，總黃酮提取率最大，進(jìn)一步增加提取劑用量，總黃酮提取率反而減小。增加提取劑的用量，物料體系與提取劑體系間的濃度差加大，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出；但過(guò)多的提取劑降低了銀杏葉總黃酮的濃度，使總黃酮的不穩(wěn)定性增大從而容易損失，反而導(dǎo)致總黃酮提取率減小。

圖1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of solid－liquid ratio on the flavonoids extraction rate

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，按1∶50的料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，在60℃下回流提取3.0h，經(jīng)純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of volume fraction of ethanol on the flavonoids extraction rate

由圖2可知，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總黃酮提取率最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)50%后，總黃酮提取率反而減小，至70%以后保持不變?？赡艿脑蚴歉唧w積分?jǐn)?shù)的乙醇更有利于黃酮類物質(zhì)的溶解，同時(shí)高體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)細(xì)胞的破壞性更強(qiáng)，有利于溶液滲透至物料中。然而，過(guò)高的乙醇體積分?jǐn)?shù)可能增加脂溶性物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率減小。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，在水浴溫度為60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶50的條件下，分別回流提取1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，提取時(shí)間為3.0h時(shí)，提取率最大，之后提取率反而減小。

2.1.4 提取溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶50，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下回流提取3.0h，純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on the flavonoids extraction rate

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大；提取溫度為70℃時(shí)，提取率最大；提取溫度超過(guò)70℃后，總黃酮提取率反而減小。這是因?yàn)?，隨著提取溫度的升高，溶劑分子的運(yùn)動(dòng)加快，黃酮類物質(zhì)溶出增加，但黃酮類物質(zhì)作為一類具有抗氧化活性的物質(zhì)，在高溫條件下，其結(jié)構(gòu)被氧化破壞的速度也會(huì)加快；同時(shí)溶出的部分蛋白質(zhì)在高溫下易變性與黃酮類物質(zhì)發(fā)生共沉淀，導(dǎo)致總黃酮提取率減小。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（表2）

由表2可以看出，提取溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比和提取時(shí)間的影響最??；最佳組合為A1B2C2D2，即料液比1∶45、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間2.0h、提取溫度70℃，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取率達(dá)到0.918%。

2.3 微波輔助對(duì)銀杏葉總黃酮提取的影響

2.3.1 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

表2 L16（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 The results and analysis of L16（34）orthogonal experiment

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶45的條件下，分別用30W、240W、400W、640W和800W5種不同的微波功率進(jìn)行微波輔助提取，純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of microwave power on the flavonoids extraction rate

由圖5可知，隨著微波功率逐步增大，總黃酮提取率相應(yīng)增大，在微波功率為640W時(shí)，總黃酮提取率最大；之后，總黃酮提取率減小?？赡苁且?yàn)?，微波的加熱作用使提取液溫度升高，或是微波本身?duì)黃酮類物質(zhì)的破壞。因此，選擇最適微波功率為640W。

2.3.2 微波間歇提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末1g，在微波功率為640W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶45、采用間歇式提取、每次10s的條件下，分別提取10次、15次、20次、25次、30次，純化后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，隨著微波間歇提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸增大；微波間歇提取時(shí)間為15×10s時(shí)，提取率最大，為0.91%；進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率快速減小，可能是由于微波產(chǎn)生的高溫或微波直接對(duì)黃酮的破壞。與傳統(tǒng)方法相比，在相同提取條件下，采用微波提取在幾分鐘內(nèi)的總黃酮提取率接近傳統(tǒng)方法3h的提取率。表明微波輔助提取能大大縮短銀杏葉總黃酮的提取時(shí)間，縮短提取周期。

圖6 微波間歇提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 The effect of microwave intermittent extraction time on the flavonoids extraction rate

3 結(jié)論

研究了乙醇回流法提取銀杏葉總黃酮的工藝條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定優(yōu)化的提取工藝條件為：料液比1∶45（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間2.0h、提取溫度70℃，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取率為0.918%。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究了微波輔助提取對(duì)銀杏葉總黃酮提取的影響，在微波功率為640W、用50%乙醇按1∶45的料液比間歇提取15次、每次10s的條件下，銀杏葉總黃酮提取率為0.91%，與傳統(tǒng)的加熱方法提取相比，大大地縮短了提取時(shí)間和提取周期。

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