紫外分光光度法測(cè)定沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量

劉洋洋，楊 云，林 波，黃俊卿

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所 海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 萬(wàn)寧 571533；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

沉香是瑞香科沉香屬植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng]含有樹脂的木材，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[1]，臨床使用廣泛，是傳統(tǒng)名貴中藥。近年來(lái)，大量研究表明沉香倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香的主要成分，從沉香中已分離鑒定了63個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物[2-3]。除沉香外，迄今僅從禾本科白茅(Imperatacylindrica)[4]、白羊草(Bothriochloaischaemum)[5]和葫蘆科甜瓜(CucumismeloL.var.reticulatus)[6]中分離得到過2-(2-苯乙基)色酮類化合物，該類化合物具有不同程度的抗過敏和神經(jīng)保護(hù)等活性[4]，是沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)性成分[7-8]。

戚樹源等[9]建立了測(cè)定6,7-二甲基-2-(2-苯乙基)色酮和6-甲氧基-2-[2-(4′-甲氧基)苯乙基]色酮含量的HPLC方法，并分析了白木香感染黃綠墨耳菌(Menanotusflavovirens)3 d后2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮化合物的含量變化。何夢(mèng)玲等[10]建立了測(cè)定6,7-二甲氧基-2-[2-(4′-甲氧基)苯乙基]色酮、6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-[2-(3′-甲氧基)苯乙基]色酮類和6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮等4種2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量的LC-MS方法，并對(duì)黃綠墨耳菌提取液誘導(dǎo)的白木香根懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量進(jìn)行分析。陳亞等[11]建立了測(cè)定沉香藥材中6-羥基-2-[2-(4′-甲氧基苯乙基)]色酮和6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮含量的HPLC方法，并對(duì)3批沉香樣品進(jìn)行分析。Okudera等[12]建立了測(cè)定沉香藥材中AH3、AH4、AH5、AH6等4個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量的HPLC方法。

2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香在形成過程中產(chǎn)生的一類化合物[13]，且其含量在不同品質(zhì)等級(jí)的沉香藥材中存在差異[7-8]?，F(xiàn)有報(bào)道[9-12]關(guān)于沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物含量測(cè)定的方法都是針對(duì)某個(gè)或數(shù)個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物建立的，難以測(cè)定或比較不同沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量。而目前關(guān)于沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量的測(cè)定方法尚未見報(bào)道。因此，作者建立了一種測(cè)定沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量的紫外分光光度法，并將其應(yīng)用于沉香藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

沉香樣品的特征及來(lái)源信息見表1。其中野生沉香藥材于2012年4月購(gòu)于海南省沉香國(guó)際博覽會(huì)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定為瑞香科植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng]含有樹脂的木材。憑證樣本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所南藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室沉香標(biāo)本庫(kù)。

表1 沉香樣品信息表

1.2 試劑與儀器

6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(含量>99%),自制；甲醇、石油醚(30～60 ℃)、乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2550型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；AR1140/C型電子天平，美國(guó)奧豪斯公司；SK8200H6型超聲波提取器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-6型水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮1.5240 mg，用甲醇溶解，定容至100 mL，即得2-(2-苯乙基)色酮類化合物對(duì)照品溶液。

供試品溶液：沉香藥材粉碎過4號(hào)篩，取沉香粉末20 mg，精密稱定，置索氏提取器中。加入70 mL石油醚，置于65 ℃水浴中回流提取3 h除去色素；再加入100 mL乙醚于50 ℃水浴中回流提取6 h?；厥杖軇瑵饪s物用甲醇溶解并定容至10 mL，即得供試品溶液。

1.3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)分別對(duì)2-(2-苯乙基)色酮類化合物對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，選擇適宜的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.3 線性關(guān)系考察

精密稱取一定量6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度(mg·L-1)為1.5625、3.125、6.250、9.375、12.500、15.625的溶液。以甲醇為空白，采用紫外分光光度計(jì)于230 nm處測(cè)定各溶液的吸光值，考察線性關(guān)系。

1.3.4 方法學(xué)考察

1)精密稱取沉香藥材E粉末樣品6份制成供試品溶液，編號(hào)1#～6#。平行測(cè)定，考察方法的重復(fù)性。

2)取1#供試品溶液，于230 nm處連續(xù)測(cè)定6次，考察方法的精密度。

3)取1#供試品溶液，于230 nm處測(cè)定吸光值，每隔30 min測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定11次，考察樣品的穩(wěn)定性。

1.4 回收率實(shí)驗(yàn)

分別取1 mL上述1#～6#供試品溶液，各加入1 mL對(duì)照品溶液(0.0152 mg·mL-1)，測(cè)定吸光值，計(jì)算回收率。

1.5 樣品測(cè)定

取不同沉香藥材粉末樣品約20 mg，精密稱定，制成供試品溶液，測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算不同沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)

2-(2-苯乙基)色酮類化合物對(duì)照品溶液和供試品溶液的紫外掃描光譜見圖1。

由圖1可知，2-(2-苯乙基)色酮類化合物對(duì)照品溶液和供試品溶液在230 nm附近均有較強(qiáng)吸收。因此，可將230 nm作為沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物紫外分光光度法的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 線性關(guān)系

以6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮溶液的質(zhì)量濃度(y)為橫坐標(biāo)、吸光值(x)為縱坐標(biāo)作圖，擬合線性回歸方程為：y=0.096x+0.043(R=0.9984，n=6)。表明，6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮溶液在1.5625～15.625 mg·L-1范圍內(nèi)，其吸光值與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。

圖1 2-(2-苯乙基)色酮類化合物對(duì)照品溶液(a)和供試品溶液(b)的紫外掃描光譜Fig.1 UV Spectra of 2-(2-phenylethyl) chromones reference solution(a) and sample solution(b)

2.3 重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2-(2-苯乙基)色酮類化合物在1#～6#樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.55%、1.58%、1.63%、1.55%、1.61%和1.60%，平均值為1.59%，RSD為2.06%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)測(cè)定6次的吸光值RSD為0.53%，表明方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)測(cè)定11次的RSD值為1.08 %，表明樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果(表3)

由表3可知，編號(hào)為E、D、C的野生沉香藥材(品質(zhì)等級(jí)分別為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí))中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量分別為1.59%、1.30%和0.98%，2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量高低與其品質(zhì)等級(jí)順序相同；編號(hào)為F的“通體香”沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量為2.73%，高于一級(jí)野生沉香藥材；編號(hào)為A采用“火烙法”在白木香樹上生產(chǎn)的沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量為1.12%，介于二級(jí)和三級(jí)野生沉香藥材之間；編號(hào)為B采用“接菌法”在白木香樹上生產(chǎn)的沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量為0.83%，低于三級(jí)野生沉香藥材。表明，采用“通體結(jié)香技術(shù)”在白木香樹上生產(chǎn)的沉香藥材品質(zhì)高于一級(jí)野生沉香藥材，遠(yuǎn)高于采用“接菌法”和“火烙法”在白木香樹上生產(chǎn)的沉香藥材。

表3 不同沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物 總含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.8 討論

2-(2-苯乙基)色酮類化合物都具有2-(2-苯乙基)色酮母核結(jié)構(gòu)，作者前期對(duì)沉香藥材中6個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物{6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6,8-二羥基-2-[2-(3′-甲氧基-4′-羥基苯乙基)]色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6,7-二甲氧基-2-[2-(4′-甲氧基)苯乙基]色酮、7-羥基-2-[2-(4′-甲氧基)苯乙基]}進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)6個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物在230 nm附近均具有較強(qiáng)的紫外吸收。在此，對(duì)沉香藥材色酮提取液和沉香藥材中主要的2-(2-苯乙基)色酮類化合物——6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，沉香藥材色酮提取液與色酮類化合物對(duì)照品溶液在230 nm附近均有較大吸收，因此，將230 nm作為紫外分光光度法的測(cè)定波長(zhǎng)。

3 結(jié)論

根據(jù)2-(2-苯乙基)色酮類化合物都具有2-(2-苯乙基)色酮母核結(jié)構(gòu)且其在230 nm波長(zhǎng)下具有較強(qiáng)吸收的特點(diǎn)，建立了測(cè)定沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量的紫外分光光度法。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法測(cè)定沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的總含量重復(fù)性好，在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，其加樣回收率為101.24%(RSD=2.25%)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、用樣少的特點(diǎn)，可用于沉香藥材中2-(2-苯乙基)色酮類化合物總含量測(cè)定，以及對(duì)不同沉香藥材進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)。

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