大孔吸附樹(shù)脂富集款冬花總黃酮的研究

李 月，李 喆

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110001;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部，吉林 長(zhǎng)春 130041)

款冬花為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾。味辛、微苦，性溫。具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰的功效，主治新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，款冬花有支氣管解痙、中樞興奮、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血小板聚集等作用，款冬二醇、蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物為其有效成分[2]。大孔吸附樹(shù)脂用于中藥制藥技術(shù)已日趨成熟，在中藥材有效部位的富集方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。作者在此進(jìn)行了大孔吸附樹(shù)脂富集款冬花總黃酮的研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

款冬花藥材購(gòu)于沈陽(yáng)天益堂，經(jīng)鑒定為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾，粉碎過(guò)40目篩，80 ℃烘干，備用。

蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200306),中國(guó)食品藥品檢定研究院；D101、HPD300、HPD600型大孔吸附樹(shù)脂，河北滄州寶恩化工有限公司；X-5、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，天津南開(kāi)大學(xué)化工廠；其它試劑均為分析純；水為純化水。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，恒溫水浴振蕩器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品液制備與總黃酮含量測(cè)定

取款冬花粉于錐形瓶中，用60%乙醇按液料比20∶1(mL∶g，下同)浸泡10 min，微波處理(微波功率300 W，處理時(shí)間9 min)，過(guò)濾，減壓濃縮，用石油醚萃取至醚層無(wú)色(除去葉綠素)，即得款冬花樣品液(其中總黃酮含量為2.76 mg·mL-1)，備用。

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定款冬花總黃酮含量[3]。以蘆丁為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=9.7511c+0.0065(R=0.9993)，線性范圍為13.2～66.0 μg·mL-1。

1.2.2 樹(shù)脂的篩選

將15 mL預(yù)處理過(guò)的不同型號(hào)濕樹(shù)脂置于具塞錐形瓶中，各加樣品液30 mL，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮含量，計(jì)算靜態(tài)吸附量。再將已吸附款冬花總黃酮的樹(shù)脂置于具塞錐形瓶中，各加入60%乙醇30 mL，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h，過(guò)濾，測(cè)定解吸液中總黃酮含量，計(jì)算解吸率。

式中：m0為吸附前樣品液的總黃酮含量；m1為吸附后濾液的總黃酮含量；V為樹(shù)脂體積；m2為解吸液的總黃酮含量。

1.2.3 AB-8大孔吸附樹(shù)脂富集款冬花總黃酮的工藝參數(shù)優(yōu)化

將4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的上樣流速通過(guò)樹(shù)脂柱(1 BV約為20 mL)，動(dòng)態(tài)吸附40 min；用4 BV純化水以1 BV·h-1的速度沖洗至幾乎無(wú)色，再用4 BV 60%乙醇以4 BV·h-1的速度洗脫至幾乎無(wú)色，收集洗脫液，回收乙醇，計(jì)算洗脫液中款冬花總黃酮的純度及回收率。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，依次考察上樣量(上樣速度為1 BV·h-1)、上樣速度、吸附時(shí)間、純化水用量、純化水沖洗速度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量對(duì)總黃酮純度和回收率的影響，確定優(yōu)化的富集工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹(shù)脂篩選結(jié)果(表1)

表1 5種大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附、解吸參數(shù)

由表1可見(jiàn)，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)款冬花總黃酮的靜態(tài)吸附量和解吸率均最高。因此，選用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂富集款冬花總黃酮。

2.2 AB-8型大孔吸附樹(shù)脂富集款冬花總黃酮的影響因素

2.2.1 上樣量

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上樣量為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV時(shí)，總黃酮的純度分別為70.5%、71.3%、72.1%、68.7%、65.8%，回收率分別為88.0%、89.2%、92.8%、74.3%、66.1%?？梢?jiàn)，上樣量為4 BV時(shí)，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)款冬花總黃酮的富集效果最好，且避免了樹(shù)脂過(guò)飽和造成的黃酮成分流失。因此，確定適宜的上樣量為4 BV。

2.2.2 上樣速度

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上樣速度為1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1時(shí)，總黃酮的純度分別為72.0%、72.3%、72.5%、64.5%，回收率分別為92.3%、91.3%、92.0%、79.8%?？梢?jiàn)，上樣速度過(guò)快，款冬花總黃酮成分流失較多；上樣速度過(guò)慢，操作時(shí)間又太長(zhǎng)。因此，確定適宜的上樣速度為3 BV·h-1。

2.2.3 吸附時(shí)間

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吸附時(shí)間為20 min、40 min、60 min時(shí)，總黃酮的回收率分別為77.6%、89.3%、84.4%?？梢?jiàn)，吸附時(shí)間過(guò)短，黃酮成分未充分吸附；吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，出現(xiàn)“死吸附”現(xiàn)象。因此，確定適宜的吸附時(shí)間為40 min。

2.2.4 純化水用量

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，純化水用量為2 BV、4 BV、6 BV時(shí)，總黃酮的純度分別為56.2%、72.2%、72.4%，回收率分別為87.7%、90.6%、79.3%。可見(jiàn)，水用量過(guò)少，雜質(zhì)未完全除去，影響洗脫液中總黃酮的純度；水用量過(guò)多，易造成黃酮成分損失。因此，綜合考慮富集效果、總黃酮的回收率和節(jié)約用水等因素，確定適宜的純化水用量為4 BV。

2.2.5 純化水沖洗速度

實(shí)驗(yàn)利用黃酮類化合物與氯化鋁反應(yīng)生成黃色熒光絡(luò)合物的性質(zhì)[4]，對(duì)水洗液進(jìn)行薄層檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化水沖洗速度為2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1時(shí)，薄層檢測(cè)均無(wú)異常，但沖洗速度達(dá)8 BV·h-1時(shí)，水洗液的薄層檢測(cè)呈淡黃色熒光，說(shuō)明出現(xiàn)了黃酮成分的流失。因此，為了既保證總黃酮的回收率又節(jié)約操作時(shí)間，確定適宜的純化水沖洗速度為6 BV·h-1。

2.2.6 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)，總黃酮的回收率分別為51.1%、78.1%、91.4%、90.1%、89.3%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～80%時(shí)無(wú)明顯差異。因此，確定適宜的洗脫劑為60%乙醇。

2.2.7 洗脫劑乙醇用量

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洗脫劑乙醇用量為3 BV、4 BV、5 BV時(shí)，總黃酮的回收率分別為77.3%、92.6%、93.2%。綜合考慮生產(chǎn)成本與生產(chǎn)周期，確定適宜的洗脫劑乙醇用量為4 BV。

2.3 AB-8型大孔吸附樹(shù)脂的穩(wěn)定性

將處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂濕法裝柱，取4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的流速上柱吸附40 min，用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì)，再用4 BV的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總黃酮的純度和回收率，重復(fù)進(jìn)行以上操作。結(jié)果，進(jìn)行到第7次實(shí)驗(yàn)時(shí)，總黃酮的純度和回收率均大幅下降，分別為48.7%和70.3%。表明，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂可以連續(xù)使用6次，之后需要進(jìn)行再生處理。

2.4 討論

1)預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，洗脫劑的洗脫速度不同時(shí)的富集效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2)有文獻(xiàn)報(bào)道，樹(shù)脂柱的徑高比也是影響富集效果的因素之一。但受實(shí)驗(yàn)室儀器安裝等具體條件的限制，本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)樹(shù)脂柱徑高比進(jìn)行考察。

3 結(jié)論

通過(guò)靜態(tài)吸附、解吸的篩選實(shí)驗(yàn)，確定富集款冬花總黃酮的樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以富集后總黃酮的純度和回收率為指標(biāo)，確定款冬花總黃酮適宜的富集工藝為：將4 BV款冬花樣品液以3 BV·h-1的速度上樣，吸附40 min，用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì)，再用4 BV的60%乙醇洗脫總黃酮。該樹(shù)脂穩(wěn)定性良好，可連續(xù)使用6次。此富集工藝簡(jiǎn)單、可行，富集所得款冬花總黃酮的純度和回收率均較高，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：312.

[2] 呂培霖，李成義，翟麗芳.款冬花化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18(12)：948-949.

[3] 宋宏新，楊芳.大孔吸附樹(shù)脂分離貫葉連翹中黃酮類化合物[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(5)：645-647.

[4] 騰坤，阮洪生，武子敬，等.大孔吸附樹(shù)脂純化藤梨根中總黃酮工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013,32(1)：63-65.