JNK信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖

劉麗華，房彩霞，鄧永貴，周 紅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050000)

心肌纖維化是糖尿病心肌病的主要病理改變之一，是由于心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度分泌和堆積的結(jié)果，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭，這與糖尿病病人心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。目前尚無(wú)更有效的藥物來(lái)防治糖尿病心肌病。抑制CFs增殖是抑制心肌纖維化的主要作用環(huán)節(jié)。已經(jīng)證實(shí)高糖能夠誘導(dǎo)CFs增殖［1－2］，但其分子機(jī)制尚不十分清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)C-JUN氨基末端激酶(C-JUN N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路在多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子致纖維化過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，并與其他信號(hào)通路存在著交互影響。本研究揭示JNK通路在高糖誘導(dǎo)CFs增殖中的作用，為糖尿病心肌病提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)出生3d的Sprague-Dawley乳鼠，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003。JNK抑制劑SP600125(德國(guó)默克公司);DMEM培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L葡萄糖)和新生胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶和MTT(Sigma公司);膠原酶Ⅱ和Trizol(Invitrogen公司);Taq Master Mixe和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司);小鼠抗大鼠波形蛋白抗體，纖維素抗體和平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體工作液(北京中衫生物技術(shù)公司);兔抗大鼠磷酸化JNK(p-JNK，183/Y185)抗體(Cell Signaling公司);兔抗大鼠JNK1/2(T178)抗體(Bioworld公司);兔抗大鼠β-actin和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(Santa Cruz公司)。C-JUN引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):取新出生3 d的Sprague-Dawley大鼠心室組織，用預(yù)冷的 D-Hanks液洗凈殘血，將心室剪碎，大約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，洗去血細(xì)胞。用0.125%胰蛋白酶+0.04%膠原蛋白酶Ⅱ連續(xù)消化成單細(xì)胞懸液，整個(gè)消化過(guò)程在37℃恒溫條件下進(jìn)行。分別收集各次消化上清液，加等量10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol/L葡萄糖)，以1 200 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)2次。離心管中加入10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基，用吸管吹打沉淀，將細(xì)胞懸液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾后接種于100 mm2的培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。90 min后棄培養(yǎng)液，采用差速貼壁去除未貼壁心肌細(xì)胞。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，按1∶2傳代，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用2～3代細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察CFs的形態(tài)學(xué)特征，并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs接種于96孔板中，每孔 CFs 5×103個(gè)(100μL/孔)。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，換0.1%胎牛血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞同步化24 h。吸棄各孔培養(yǎng)基，分為高滲組(OSM:含5.5 mmol/L葡萄糖 +19.5 mmol/L甘露醇)，對(duì)照組(NG:含5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖組(HG:含25 mmol/L葡萄糖)，HG+SP600125組(10、20μmol/L)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用0.1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔中加入5 g/L的 MTT 20μL，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100μL DMSO，振蕩15 min后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm處測(cè)定吸光度值(A490值)。

1.2.3 Western blot測(cè)定蛋白表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs接種于6孔培養(yǎng)板中(2×105個(gè)/孔)，應(yīng)用不同糖濃度(12、18和25 mmol/L葡萄糖)刺激48 h后收集細(xì)胞;并且在高糖(25 mmol/L葡萄糖)下刺激不同時(shí)間(12、24和48 h)收集細(xì)胞;以及按上述分組后培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。分別將這些細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞 2次，加入1 mL蛋白裂解液，12 000 r/min，離心10 min。吸取上清液采用 BCA法測(cè)定總蛋白含量。取20μg蛋白加樣至10%SDSPAGE凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，用抗JNK，抗p-JNK，抗PCNA和抗β-actin抗體在4℃孵育過(guò)夜，沖洗。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描。JNK磷酸化水平以p-JNK與JNK的吸光度比值表示，PCNA蛋白表達(dá)以其與β-actin吸光度比值表示。

1.2.4 RT-PCR測(cè)定C-JUN基因表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs接種于6孔培養(yǎng)板中，分組后培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。用Trizol提取總RNA，用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定其純度。取5μg RNA在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成單鏈的cDNA;取5μg反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。C-JUN上游引物為5'-AATGGGCACATCACCAC TACAC-3'，下游引物為5'-CGTCTGCGGCTCTTCCTT CA-3';產(chǎn)物大小為450 bp。GAPDH上游引物為5'-GATGGGTGTGAACCACGAGAAA-3'，下游引物為5'-ACGGATACATTGGGGGTAGGAA-3';產(chǎn)物大小為330 bp。C-JUN的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s;61℃退火30 s;72℃延伸30 s;30個(gè)循環(huán)。GAPDH的反應(yīng)條件:預(yù)變性和變性同C-JUN，55℃退火30 s;72℃延伸30 s;28個(gè)循環(huán)。取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳;凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，結(jié)果以C-JUN與GAPDH吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單因素方差分析及Student-Newman-Keuls'檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 CFs的鑒定

倒置顯微鏡下可見(jiàn)CFs呈梭形，胞質(zhì)透明，胞核較大，呈橢圓形，通常含2～3個(gè)核，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。錐蟲藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力，活細(xì)胞率達(dá)98%?？共ㄐ蔚鞍住⒗w維連接蛋白染色呈陽(yáng)性;抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性，符合上述條件即鑒定為CFs，純度達(dá)95%(圖1)。

2.2 高糖和SP600125對(duì)CFs增殖的影響

與對(duì)照組比較，高糖組吸光度顯著增高(p＜0.01)。HG+SP600125(10，20μmol/L)組吸光度較高糖組分別降低了12.7%(p＜0.05)和21.8%(p＜0.01)(圖2B)。

2.3 高糖和SP600125對(duì)JNK活性和PCNA表達(dá)的影響

將細(xì)胞暴露于25 mmol/L高糖中，與對(duì)照組比較，不同的刺激時(shí)間均顯著地增加p-JNK，而總JNK無(wú)顯著變化，p-JNK/JNK顯著增加(p＜0.05，p＜0.01)(圖3A)。從糖濃度分析，與對(duì)照組比較，不同的糖濃度均顯著地增加JNK磷酸化(p＜0.05，p＜0.01)，且表現(xiàn)出濃度依賴性(圖3B)。高糖也顯著增加了PCNA蛋白表達(dá)(p＜0.01)。在高糖刺激的細(xì)胞中加入SP600125(10，20μmol/L)與高糖組比較則顯著地抑制了高糖誘導(dǎo)的JNK磷酸化的增加(p＜0.01)(圖4A)及PCNA蛋白表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01)(圖2A)。

2.4 高糖和SP600125對(duì)C-JUN基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，高糖顯著上調(diào)了C-JUN基因表達(dá)(p＜0.01)。在高糖刺激的細(xì)胞中加入SP600125(10，20μmol/L)，與高糖組比較能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的C-JUN基因表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01)(圖4B)。

圖1 心肌成纖維細(xì)胞免疫化學(xué)染色特征Fig 1 The features of immunocytochemical staining in CFs(×400)

3 討論

CFs占心臟中非心肌細(xì)胞的90% ～95%，是合成膠原的重要細(xì)胞，也稱為心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，心肌纖維化在糖尿病心肌病的形成中起著重要作用［3］。本研究探討了高糖對(duì)CFs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境中CFs增殖加速，這與國(guó)外的許多報(bào)道一致［1－2，4］。單純高滲透壓對(duì)CFs增殖沒(méi)有影響，提示只是高糖而不是滲透壓的改變刺激了CFs增殖。

圖4 高糖和SP600125對(duì)JNK活性和C-JUN mRNA表達(dá)的影響Fig 4 The effects of HG and SP600125 on JNK activity and expression of C-JUN mRNA in CFs(，n=6)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)是細(xì)胞膜信號(hào)向核信號(hào)傳遞的樞紐，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、JNK、P38 MAPK，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育以及凋亡等一系列行為和功能。文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］高糖能夠刺激成纖維細(xì)胞上ERK1/2和P38 MAPK通路，但高糖與JNK通路的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。通常ERK1/2通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，而JNK和P38 MAPK調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡。但新近的研究［6－8］顯示 JNK是纖維化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)者，甚至在細(xì)胞增殖中JNK的激活比ERK1/2更為重要。作為JNK的下游靶點(diǎn)，C-JUN是多種基因的轉(zhuǎn)錄因子，這些基因的過(guò)度表達(dá)與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖密切相關(guān)［6，9］。已有研究表明JNK的激活包含在了心肌纖維化的形成機(jī)制中［10］。本研究顯示高糖能夠以時(shí)間和濃度依賴性地激活JNK1/2，使得其下游的C-JUN表達(dá)增加。JNK抑制劑SP600125不但抑制了JNK的活性，而且抑制了PCNA的表達(dá)和CFs增殖。這些結(jié)果表明JNK信號(hào)通路部分地參與了高糖誘導(dǎo)的CFs增殖過(guò)程。雖然以往的研究［11］表明JNK通路也可能被高滲透壓激活，但本研究顯示高滲透壓對(duì)JNK通路沒(méi)有影響，這可能與研究中所選擇的滲透壓增高程度和細(xì)胞系種類有關(guān)。

本研究結(jié)果提示JNK通路在高糖誘導(dǎo)CFs增殖中起著重要作用，抑制JNK通路有可能阻止糖尿病心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展，這些還需要進(jìn)一步在體研究所證實(shí)。

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