幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)FOS蛋白表達升高與母嬰分離相關(guān)

林濱榕，吳國媛，吳 斌，陳素清，林 春

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.兒科;2.疼痛研究室，福建福州350005)

新生兒期是嬰兒期的特殊階段，新生兒期母嬰分離(maternal separation，MS)是一個應(yīng)激源，是生命早期最為常見的負性生活事件［1］;新生兒期倘若剝奪嬰兒與母親的接觸，將對該嬰兒的生長和發(fā)育產(chǎn)生持續(xù)性的影響。已證實:新生兒期MS很可能使該嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的成熟被阻斷，導(dǎo)致覺醒調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、注意力和學(xué)習(xí)能力的終生損害［2］，對心理行為造成不同程度的影響。本實驗通過研究幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)FOS蛋白表達與母嬰分離的相關(guān)性，探討母嬰分離對大鼠成年后行為影響可能的機制，為臨床上防治因新生期MS可能引起的危害及疾病提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 動物及分組

新生清潔級SD大鼠共32只，雌雄各半(上海斯萊克實驗動物有限公司)［實驗動物許可證號:SCXK(滬)2003-0003］。出生后當天定為第1天，根據(jù)析因設(shè)計方案，根據(jù)出生后第2天按是否給予MS、6周齡時是否接受結(jié)直腸擴張(colorectal distention，CRD)刺激兩因素兩水平，采用隨機數(shù)據(jù)表法，將32只大鼠隨機分成4組，每組8只。A1B1組:新生期給予MS，并在6周齡時接受CRD;A1B2組:新生期給予MS，但在6周齡時未接受CRD;A2B1組、A2B2組同為對照組，A2B1組:新生期未給予MS，而在6周齡時接受CRD;A2B2組:新生期未給予MS，且在6周齡時未接受CRD。各組大鼠繼續(xù)鼠乳喂養(yǎng)至21 d，第22天斷奶，第30天雌雄分籠，采用混合配方飼料喂養(yǎng)至6周，自由進食飲水，每日更換飲水、飲料，保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。觀察大鼠每天進食、飲水、活動及大小便情況，確保大鼠健康及避開各種傷害性刺激。

1.2 材料

兔抗FOS單克隆抗體(批號l1106)和SABC試劑盒(批號45038)，均北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新生期 MS方法［3－4］:新生大鼠出生后第2～14 天，每天與母鼠分離3 h(8∶00 ～11∶00am)，即:將母鼠拎出放入一籠中，然后將新生大鼠放入另一籠中，移至另一鄰近房間，溫度保持在27～30℃，進行MS，3 h后將新生大鼠返回最初籠中與母鼠團聚，連續(xù)13 d。

1.3.2 CRD刺激方法:為保證大鼠健康且腸道清潔，實驗時操作順利，幼鼠在實驗前18 h禁食不禁水，乙醚麻醉后，將外涂石蠟油的氣囊插入結(jié)直腸內(nèi)，使氣囊末端深入肛門內(nèi)1.0 cm，在肛門外1.0 cm處用膠布將導(dǎo)管固定在鼠尾根部，導(dǎo)管經(jīng)三通管連接注射器和血壓計。將幼鼠置于有機玻璃觀察箱(20 cm×6 cm×8 cm)中，幼鼠能自由前后活動但不能轉(zhuǎn)身，待幼鼠蘇醒并完全適應(yīng)環(huán)境30 min后開始實驗。

1.3.3 幼鼠下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)和前皮質(zhì)扣帶回(anterior cingulated cortex，ACC)FOS蛋白檢測:1)FOS蛋白免疫組織化學(xué)染色，常規(guī)方法制備PVN和ACC腦組織切片后，應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)法對PVN和ACC切片進行FOS染色，具體步驟如下:1)石蠟切片脫蠟至水;2)壓力鍋抗原修復(fù)，PBS洗滌，2 min×3次;3)3%H2O2室溫孵育5～10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;4)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min;5)滴加兔抗FOS抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜或37℃孵育1～2 h;PBS洗滌，5 min×3次;6)滴加生物素標記的羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37℃孵育30～60 min;7)滴加SABC，室溫20 min;PBS沖洗，5 min×3次;8)顯色、沖洗，復(fù)染，封片。用PBS液代替一抗作為陰性對照。2)不同腦區(qū)FOS蛋白檢測，BX51型數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus)對每張腦切片進行圖像采集，放大倍數(shù)為40倍(像素4080×3072)。FOS蛋白陽性神經(jīng)元細胞核呈均勻黃至深棕色(FOS蛋白陰性神經(jīng)元為在細胞核周邊呈現(xiàn)淡藍色)。在相同倍數(shù)下，每張切片隨機選取3個視野，計數(shù)3個視野平均FOS陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

經(jīng)處理后腦區(qū)切片中可見FOS陽性神經(jīng)元細胞核呈均勻黃至深棕色，而在陰性對照組中下丘腦PVN及ACC內(nèi)神經(jīng)元均沒有棕色FOS蛋白表達。實驗中，4組幼鼠的下丘腦PVN和ACC內(nèi)神經(jīng)元均有不同程度的FOS蛋白免疫陽性 (Fos-like Immunoreactivity，F(xiàn)LI)細胞表達 (圖1，2)，A1B1組下丘腦PVN或ACC內(nèi)出現(xiàn)密集棕黃色免疫陽性產(chǎn)物，F(xiàn)OS陽性細胞多;A1B2組和A2B1組，下丘腦PVN或ACC內(nèi)均有免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色沉積在細胞質(zhì)，F(xiàn)OS陽性細胞較多;A2B2組下丘腦PVN或ACC內(nèi)僅有極少量FOS陽性細胞，免疫陽性產(chǎn)物著色淺淡。

2.1 下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)結(jié)果分析

新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD刺激兩種因素均使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)表達增加。新生期MS的主效應(yīng)為10.03，即新生期給予MS使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)平均增加10.03個;幼鼠6周齡時接受CRD刺激的主效應(yīng)為22.45，即幼鼠6周齡時接受CRD刺激使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)平均增加22.45個 (表1)。

幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)受到新生期是否給予MS以及幼年期是否接受CRD刺激的影響;新生期給予MS和幼年期接受CRD刺激，均導(dǎo)致其下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)明顯增多。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激，兩者之間無明顯交互作用(表2)。

2.2 ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)結(jié)果分析

新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD刺激兩種因素均使幼鼠ACC內(nèi)FIL細胞數(shù)表達增加。新生期MS的主效應(yīng)為18.38，即新生期給予MS使幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)平均增加18.38個;幼鼠6周齡時接受CRD刺激的主效應(yīng)為14.98，即幼鼠6周齡時接受CRD刺激使幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)平均增加14.98個(表3)。

圖1 各組幼鼠下丘腦室旁核FOS陽性細胞表達情況(免疫組織化學(xué)染色，×100)Fig 1 The expressions of the FLI cells in PVN following neonatal MS and/or infant CRD(immunohistochemical staining，×100)

圖2 各組幼鼠前皮質(zhì)扣帶回FOS陽性細胞表達情況(×100)Fig 2 The expressions of the FLI cells in ACC following neonatal MS and/or infant CRD(immunohistochemical staining，×100)

表1 各組幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)2×2析因分析結(jié)果Table 1 The analysis of a 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in PVN of infant rats，n=8)

表1 各組幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)2×2析因分析結(jié)果Table 1 The analysis of a 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in PVN of infant rats，n=8)

effects yes(A1)neonatal MS infant CRD yes(B1) no(B2 mean simple)50.61±11.68 31.25±7.28 40.93 19.36 no(A2) 43.67±16.03 18.13±3.41 30.90 25.54 mean 47.14 24.69 22.45 simple effects 6.94 13.12 10.03

表2 PVN內(nèi)FLI細胞數(shù)析因設(shè)計方差分析結(jié)果Table 2 The ANOVA of 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in PVN

表3 各組幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)2×2析因分析結(jié)果Table 3 The analysis of a 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in ACC of infant rats，n=8)

表3 各組幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)2×2析因分析結(jié)果Table 3 The analysis of a 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in ACC of infant rats，n=8)

effects yes(A1)neonatal MS infant CRD yes(B1) no(B2 mean simple)53.48±15.45 38.42±11.67 45.95 15.06 no(A2) 35.02±9.80 20.13±2.08 22.58 14.89 mean 44.25 29.28 14.88 simple effects 18.46 18.29 18.38

幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)受到新生期是否給予MS以及幼年期是否接受CRD刺激的影響;新生期給予MS和幼年期接受CRD刺激，均導(dǎo)致其ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)明顯增多。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激，兩者之間無明顯交互作用(表4)。

表4 各組幼鼠ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)析因設(shè)計方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA of 2×2 factorial design for the FLI cell numbers in ACC

3 討論

母嬰分離是人類早期生命應(yīng)激事件。國外報道，10%左右新生兒出生后需要進入NICU進行監(jiān)護治療，由此造成的產(chǎn)后新生期母嬰分離，嚴重影響孩子的身心健康;母體的存在，不僅僅為嬰兒提供了生存所必須的溫暖、營養(yǎng)和吮吸，還可以調(diào)節(jié)許多生理、行為和精神方面的發(fā)展過程。國內(nèi)外大多數(shù)研究認為，新生期MS將對下丘腦-垂體-腎上腺素軸活動、內(nèi)臟高敏感性、腸道黏膜屏障功能異常、神經(jīng)系統(tǒng)的成熟及其他心理健康方面造成長期的影響。反復(fù)的新生期母嬰分離可能誘發(fā)兒童注意缺陷多動障礙綜合征、精神分裂癥，重度抑郁癥及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等［5］。許多研究表明，早期母嬰分離通過影響子代的神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)、谷氨酸、神經(jīng)營養(yǎng)因子及乙酰膽堿能系統(tǒng)，對子代的心理、行為和認知發(fā)育可產(chǎn)生不利影響，可增強其成年后對內(nèi)臟傷害性刺激的神經(jīng)反應(yīng)，從而促進身體及心理障礙疾病的發(fā)生、發(fā)展。母嬰分離這種早期負性事件，可引起中樞神經(jīng)長期改變，提示母嬰分離可能致敏了腦-腸軸上的神經(jīng)化學(xué)通路［6］。

已證實［7－8］:在外周神經(jīng)末梢、脊髓及大腦皮質(zhì)等多個水平發(fā)生的病理生理改變均可以影響、調(diào)節(jié)內(nèi)臟痛感覺的產(chǎn)生;內(nèi)臟感覺通路上的許多神經(jīng)遞質(zhì)，包括C-FOS和降鈣素基因相關(guān)肽等在不同神經(jīng)控制水平發(fā)揮重要作用;人類C-FOS基因為即早基因，在包括神經(jīng)元在內(nèi)的絕大多數(shù)細胞中均有低水平表達，受到刺激時，C-FOS就被激活，其產(chǎn)物FOS蛋白在細胞對外界刺激-轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的信息傳遞過程中起著核內(nèi)“第三信使”的重要作用。研究表明，傷害性刺激可引起C-FOS在與痛覺傳遞有關(guān)的神經(jīng)元細胞內(nèi)表達，而且，慢性應(yīng)激較急性應(yīng)激可導(dǎo)致更為廣泛而持久的C-FOS表達，F(xiàn)OS蛋白在機體受到外界傷害性刺激后，主要表達在與痛覺傳遞有關(guān)的神經(jīng)元細胞內(nèi)，所以可作為傷害性感受神經(jīng)元的興奮標志物。

下丘腦PVN、ACC及中縫核等腦區(qū)是幼鼠大腦中樞內(nèi)臟傷害性刺激信號傳導(dǎo)處理過程和感(知)覺的重要區(qū)域，是腦-腸軸的高級中樞，其激活和致敏在新生期MS誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛高敏性中起到至關(guān)重要作用。已證實:FOS蛋白可出現(xiàn)在上述如下丘腦PVN、ACC及中縫核等多個與痛覺密切相關(guān)的腦區(qū)。PVN屬“下丘腦促垂體區(qū)”，與腦干、邊緣系統(tǒng)、脊髓及垂體等均有密切的聯(lián)系，在下丘腦對內(nèi)臟活動的調(diào)節(jié)中占有重要地位。PVN的小細胞神經(jīng)元發(fā)出的軸突多終止于下丘腦基底部的正中隆起，與初級毛細血管網(wǎng)密切接觸，其分泌物可直接釋放到垂體門靜脈血管的血液中。ACC是邊緣系統(tǒng)的一部分，屬于內(nèi)側(cè)痛覺系統(tǒng)，接受丘腦中線核和板內(nèi)核的纖維投射，板內(nèi)核傳遞的傷害性信號來自脊髓背角的傷害感受神經(jīng)元，ACC主要參與痛情緒的編碼。此外，除內(nèi)側(cè)和外側(cè)痛覺系統(tǒng)外，兩者間還存在皮質(zhì)-邊緣系統(tǒng)通路，該通路終止于邊緣系統(tǒng)，與內(nèi)側(cè)痛覺系統(tǒng)在ACC匯集，因此，ACC在痛覺的形成中處于樞紐的位置，痛感覺和情緒在此整合而形成完整的痛覺體驗?；赑VN和ACC在內(nèi)臟痛覺形成中的重要作用，故腸道傷害性刺激后相關(guān)部位FOS蛋白表達必然升高。本研究通過對PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達的檢測，以探討中樞FOS蛋白表達與母嬰分離的關(guān)系，探索母嬰分離對大鼠成年后行為影響可能的機制，并為臨床疾病的預(yù)防、癥狀的改善和治療提供有價值的新途徑。

母嬰分離使幼鼠對應(yīng)激反應(yīng)強烈，在此基礎(chǔ)上予以應(yīng)激刺激可使中樞神經(jīng)元活性明顯增加，不同腦區(qū)FOS蛋白表達顯著增強［9－10］，說明母嬰分離對誘導(dǎo)中樞不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白表達有活化作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)C-FOS的異常表達可能參與大鼠內(nèi)臟敏感性異常的調(diào)節(jié)［12］。在本研究中，給予MS的A1B2組幼鼠大腦的PVN和ACC內(nèi)FLI細胞均較未給予MS的A2B2組有較明顯增加;而給予MS的A1B1組與未給予MS的A2B1組相比，同樣在6周齡時接受CRD，在PVN和ACC內(nèi)均出現(xiàn)大量FLI神經(jīng)元，F(xiàn)OS蛋白呈過度表達狀態(tài)。結(jié)果顯示，正常幼鼠PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達的基礎(chǔ)水平很低;新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD均分別造成幼鼠PVN和ACC內(nèi)FLI細胞數(shù)明顯增加;與新生期未給予MS的幼鼠相比，新生期給予MS后，在6周齡時受到CRD刺激可引起該組幼鼠更為明顯的FOS蛋白表達。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激，兩者之間無明顯交互作用。此研究結(jié)果表明幼鼠在正常生活狀態(tài)下，PVN和ACC內(nèi)存在著不同程度的FOS蛋白基礎(chǔ)低表達，當給予MS后，可引起幼鼠的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)，PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達增加;在此基礎(chǔ)上接受CRD刺激，則出現(xiàn)PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白異常高表達和釋放。這證實了新生期MS使PVN和ACC的長期敏化的同時，還顯著提高了其對傷害性內(nèi)臟刺激的反應(yīng)活性，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致［9－12］。

總之，ACC、PVN是幼鼠大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)臟傷害性刺激信號傳導(dǎo)處理過程和感(知)覺的重要區(qū)域。本研究證明了PVN和ACC內(nèi)神經(jīng)元FOS蛋白異常高表達可能與內(nèi)臟痛覺高敏感性有關(guān)。新生期MS可導(dǎo)致PVN和ACC神經(jīng)元激活和致敏，出現(xiàn)發(fā)育異常及功能高敏感性，接受傷害性CRD后，能顯著引起這些部位中樞神經(jīng)元的FOS蛋白高表達而參與內(nèi)臟痛高敏感性的形成。

［1］卓玲，吳斌．新生期母嬰分離對大鼠的遠期影響［J］．國際兒科學(xué)雜志，2008，35:130 －134．

［2］楊燕珍，吳斌．新生鼠母嬰分離對心理行為的影響及相關(guān)機制［J］．中國婦幼健康研究，2008，19:479－481．

［3］Chung EKY，Zhanga XJ，Lia Z，et al．Neonatal maternal separation enhances central sensitivity to noxious colorectal distention in rat［J］．Brain Res，2007，1153:68 －77．

［4］Ren TH，Wu J，Yew D，et al．Effects of neonatal maternal separation on neurochemical and sensory response to colonic distension in a rat model of irritable bowel syndrome［J］．Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292:G849 －G856．

［5］張鴻燕，朱小霞．新生期母嬰分離對大鼠成年后行為的影響及機制［J］．中國婦幼保健，2011，26:2984－2986．

［6］Coutinho SV，Plotsky PM，Sablad M，et al．Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat［J］．Am J Physiol Gsatronitest Liver Physiol，2002，282:G307 －316

［7］Marchands S．The physiology of pain mechanisms:from the periphery to the brain［J］．Rheum Dis Clin N Am，2008，34:285－309．

［8］Anand P，Aziz Q，Willert R，et al．Peripheral and central mechanisms of visceral sensitization in man［J］．Neurogastroenterol Motil，2007，19:29 －46．

［9］Brian JS，Alan A．Maternal Separation Enhances Neuronal Activation and Cardio-vascular Responses to Acute Stress in Borderline Hypertensive Rats［J］．Behav Brain Res．2007，183:25－30．

［10］Chung EKY，Zhanga XJ，Lia Z，et al．Neonatal maternal separation enhances central sensitivity to noxious colorectal distention in rat［J］．Brain Res，2007，1153:68 － 77．

［11］楊敏，李兆申，房殿春，等．食管酸灌注對內(nèi)臟高敏感模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的影響［J］．中華消化雜志，2006，26:448 －452．

［12］孫剛，楊云生，彭麗華，等．腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性異常與結(jié)腸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT和c-fos表達的關(guān)系［J］．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2008，17:313－317．