P38 MAPK信號通路參與BMP-13誘導C3H10T1/2細胞向心肌樣細胞分化

孫文靜，陳 沅，張 芬，陳 露，陳妙月，耿雪靜，朱高慧

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院1.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室;2.心血管內(nèi)科，重慶400014)

心血管疾病一直是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。干細胞移植可以促進心肌細胞再生，實現(xiàn)心臟壞死區(qū)細胞重建，恢復心肌功能。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β家族，最初是作為成骨因子，在后期研究中發(fā)現(xiàn)BMPs是心臟發(fā)育的關(guān)鍵因子［1］，可以誘導干細胞向心肌分化。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)BMP-13能使具有多向分化潛能的C3H10T1/2細胞分化為心肌樣細胞并改善心肌梗死大鼠的心功能［2－3］，但誘導分化的作用機制仍不明了。有研究表明，BMP2、4 可以激活 P38 MAPK［4－5］，BMP-13 作為BMPs亞型之一，在誘導干細胞分化為心肌樣細胞過程中，是否也存在P38 MAPK的激活，目前尚未有報道。本研究將檢測BMP-13是否能夠激活P38 MAPK信號通路，進而通過RNA干擾技術(shù)和P38特異性抑制劑SB203580分別阻斷P38 MAPK信號通路后，探討P38 MAPK在調(diào)控C3H10T1/2細胞成心肌樣分化過程中的作用。通過對分化機制的研究為能夠更有效地誘導干細胞向心肌樣細胞分化提供一定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

C3H10T1/2細胞和BMP-13腺病毒(Ad-BMP-13)、空載腺病毒(Ad-GFP)、P38 MAPK干擾腺病毒(Ad-si-P38)和干擾對照腺病毒(Ad-si-NC)(由美國芝加哥大學醫(yī)學分子腫瘤實驗室惠贈)。DMEM培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司);RNA提取試劑盒(BioTake公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，PCR引物序列由鼎安公司合成;全蛋白提取試劑盒和ECL檢測液(KeyGEN公司)，兔抗鼠cTnT抗體和兔抗鼠Cx43抗體(Abcam公司)，鼠抗鼠磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)抗體和兔抗鼠總P38 MAPK(t-P38 MAPK)抗體(CST公司);P38特異性抑制劑SB203580(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 C3H10T1/2細胞培養(yǎng)及Ad-BMP-13的轉(zhuǎn)染:方法見參考文獻［6］。

1.2.2 免疫熒光檢測p-P38 MAPK的細胞定位:Ad-BMP-13誘導C3H10T1/2細胞24 h后進行免疫熒光檢測，方法見參考文獻［2］。

1.2.3 Western blot檢測 p-P38、t-P38 MAPK、cTnT和Cx43的表達

1.2.3.1 檢測 p-P38、t-P38 MAPK的表達:實驗分組:1)BMP-13組:Ad-BMP-13轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細胞24 h組;2)GFP組:Ad-GFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細胞24 h組;3)C3H10組:不經(jīng)任何處理的C3H10T1/2細胞。1.2.3.2 檢測Ad-si-P38對t-P38 MAPK的作用:實驗分組:1)si-P38組:Ad-si-P38轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細胞24 h組;2)si-NC組:Ad-si-NC轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細胞24 h組;3)C3H10組:不經(jīng)任何處理的C3H10T1/2細胞。

1.2.3.3 Ad-si-P38阻斷P38 MAPK后檢測BMP-13誘導的cTnT、Cx43表達變化:實驗分組:1)si-P38+BMP-13組:Ad-si-P38預(yù)處理 BMP-13誘導組;2)si-NC+BMP-13組:Ad-si-NC預(yù)處理BMP-13誘導組;3)si-NC+GFP組:Ad-si-NC預(yù)處理Ad-GFP轉(zhuǎn)染組;4)C3H10組:不經(jīng)任何處理的C3H10T1/2細胞。分別預(yù)處理24 h，繼續(xù)培養(yǎng)21 d。

1.2.3.4 Western blot方法:分別收集細胞提取蛋白，BCA法測定濃度，經(jīng)SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)膜，牛血清白蛋白封閉，一抗 p-P38 MAPK(1∶2 000)、t-P38 MAPK(1∶1 000)、cTnT(1∶2 000)和 Cx43(1∶2 000)及β-actin(1∶500)4℃孵育過夜，洗膜，二抗孵育，ECL化學發(fā)光，凝膠成像顯影，軟件分析吸光度值。實驗重復3次。

1.2.4 熒光定量PCR檢測GATA-4和MEF-2C的mRNA表達

1.2.4.1 Ad-si-P38阻斷P38 MAPK后檢測BMP-13誘導的GATA-4和MEF-2C的mRNA表達:實驗分組:1)si-P38+BMP-13組;2)si-NC+BMP-13組;3)si-NC+GFP組;4)C3H10組。

1.2.4.2 SB203580阻斷P38 MAPK后檢測BMP-13誘導的GATA-4和MEF-2C的mRNA表達:實驗分組:BMP-13+DMSO，SB2、SB5和 SB10組分別為BMP-13加 DMSO，2、5和10μmol/L SB203580。不同處理因素分別預(yù)處理6 h后，轉(zhuǎn)染Ad-BMP-13。

1.2.4.3 熒光定量PCR方法:經(jīng)過不同處理，培養(yǎng)7 d后提取 RNA，測 RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄 cDNA－20℃?zhèn)溆?。引物序?GATA-4:5'-CCCTCCCGC ACGATTTCT-3'(上游)，5'-AGAGGCCCAACTCGCTC AA-3'(下游);MEF-2C:5'-GCGCAGGGAATGGATA CGG-3'(上游)，5'-TGCCAGGTGGG ATAAGAACG-3'(下游);β-actin:5'-CACACCCGCCACCAGTTCG-3'(上游)，5'-GTCCTTCTGACCCATTCCCACC-3'(下游)。退火溫度60 ℃。用 β-actin 作內(nèi)參，2－ΔΔCt示基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BMP-13可以激活P38 MAPK信號通路

2.1.1 免疫熒光檢測磷酸化P38 MAPK的細胞定位:Ad-BMP-13轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細胞，轉(zhuǎn)染效率達到40%以上。BMP-13誘導組p-P38 MAPK表達于胞質(zhì)和胞核中，但主要見于胞核(圖1)。

2.1.2 Western blot檢測P38 MAPK的磷酸化水平:BMP-13誘導組的p-P38 MAPK表達量較空載腺病毒 GFP組和 C3H10空白組明顯升高(分別2.320±0.154、0.336±0.017和0.257±0.026)(p＜0.05)。各組間t-P38 MAPK的表達無顯著差異分別是(0.462±0.038、0.502±0.042和0.459±0.025)(圖2)。

2.2 P38干擾腺病毒可以降低t-P38 MAPK表達

si-P38組t-38MAPK的表達量明顯低于si-NC組和C3H10空白組分別是(0.161±0.096、0.904±0.020和1.026±0.156)(p＜0.05)(圖3)。

圖1 BMP-13誘導組p-P38 MAPK的細胞定位Fig 1 The position of p-P38 MAPK in BMP-13-induced group(×400)

2.3 干擾腺病毒阻斷P38 MAPK后抑制BMP-13誘導C3H10T1/2細胞向心肌樣細胞分化

2.3.1 Western blot檢測cTnT、Cx43的蛋白表達:si-NC+BMP-13組cTnT、Cx43的蛋白表達水平顯著高于si-NC組和空白組(p＜0.05);si-P38+BMP-13組cTnT、Cx43的蛋白表達顯著低于si-NC/BMP-13組(P ＜0.05)(圖4，表1)。

圖4 Cx43、cTnT的表達Fig 4 Expression of Cx43 and cTnT

表1 各組Cx43、cTnT的表達Table 1 The expression of Cx43 and cTnT in each group

2.3.2 熒光定量PCR檢測心臟早期發(fā)育基因GATA-4、MEF-2C的 mRNA表達:si-NC+BMP-13組 GATA-4、MEF-2C水平顯著高于Ad-si-NC組和空白組(p＜0.05);si-P38+BMP-13組的GATA-4、MEF-2C水平顯著低于si-NC+BMP-13組(p＜0.05)(圖5)。

圖5 GATA-4、MEF-2C的表達Fig 5 Expression of GATA-4，MEF-2C

2.4 SB203580阻斷P38 MAPK的活性后檢測GATA-4、MEF-2C的mRNA表達

利用不同濃度(2、5和10μmol/L)的SB203580分別處理細胞后，SB203580預(yù)處理的BMP-13誘導組GATA-4、MEF-2C的表達與BMP13+DMSO組比較有明顯降低(p＜0.05);隨SB203580濃度的增加，GATA-4、MEF-2C的表達也逐漸降低(圖6)。

圖6 各組GATA-4、MEF-2C的表達Fig 6 The expression of GATA-4，MEF-2C in each group

3 討論

C3H10T1/2細胞屬于間充質(zhì)干細胞，由于具有很強的增殖能力和多向分化潛能，作為種子細胞，被廣泛應(yīng)用于干細胞移植治療心肌損傷中［7］。干細胞的體外定向誘導分化一直是大家研究的熱點，已報道的參與心臟發(fā)育的 BMPs主要為 BMP2、4、5、6、7 和9 等亞型［1，8］。但對 BMP-13研究報道較少，因此本研究對BMP-13誘導干細胞向心肌樣細胞分化潛能以及作用機制進行了探討。前期證實BMP-13能促C3H10T1/2細胞分化為心肌樣細胞并改善心肌梗死大鼠的心功能［2－3］，但對其分化機制仍不明了。

近年來BMP非經(jīng)典Smad信號通路已成為研究熱點，有研究發(fā)現(xiàn)P38絲裂原蛋白活化激酶(P38 MAPK)可以被BMPs激活［9］。通過免疫熒光技術(shù)進行細胞定位，發(fā)現(xiàn)p-P38 MAPK位于胞質(zhì)和胞核，主要見于胞核。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-13誘導組較GFP對照組和C3H10組p-P38 MAPK的表達量明顯升高，表明 BMP-13可以激活P38 MAPK磷酸化。P38 MAPK信號通路干擾RNA由于其阻斷更精確，特異性更強，被用于機制的研究。本實驗采用P38干擾腺病毒抑制P38 MAPK表達后顯著降低了BMP-13誘導的 cTnT、Cx43，GATA-4、MEF-2C 表達量。P38 MAPK的特異性抑制劑SB203580抑制P38 MAPK的活性后，BMP-13誘導的GATA-4、MEF-2C明顯降低。本實驗研究結(jié)果表明:BMP-13可以激活P38 MAPK而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;P38 MAPK的激活可以促進干細胞向心肌樣細胞分化。據(jù)此推測BMP-13的高表達激發(fā)一系列磷酸化級聯(lián)放大效應(yīng)，磷酸化P38 MAPK進入細胞核，激活心肌早期核轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF-2C，影響cTnT和Cx43的表達，進而推測多向分化潛能的干細胞具有收縮并且趨于同步的可能。近來有研究表明，P38α基因敲除的干細胞不能分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和骨骼肌細胞［10］，由此表明P38 MAPK在成肌分化過程中發(fā)揮重要作用。也有報道稱P38 MAPK通路在胚胎干細胞向心肌分化過程中發(fā)揮重要作用［11－12］，這也與上述研究結(jié)果相佐證。

本實驗主要發(fā)現(xiàn)P38 MAPK介導了干細胞向心肌分化的信號傳導，對于干細胞向心肌分化的機制有了進一步了解，并為干細胞臨床應(yīng)用治療心臟疾病提供理論依據(jù)。

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